EFECTO DEL MÉTODO DE RUPTURA CELULAR SOBRE LA CALIDAD DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES EXPRESADAS EN E. coli

PARCERISA IL; MORALES ES; CECCARELLI EA

Rosario

Congreso; XX Congreso y XXXVIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario 2018; 2018

Facultad de Cs Médicas - UNR

EFECTO DEL MÉTODO DE RUPTURA CELULAR SOBRE LA CALIDAD DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES EXPRESADAS EN E. coliMorales, Enrique S; Parcerisa, Ivana L; Ceccarelli, Eduardo AInstituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (UNR ? Conicet), Ocampo y Esmeralda (2000) Rosario. E-mail: morales@ibr-conicet.gov.arUna estrategia comúnmente utilizada para la obtención de proteínas puras en grandes cantidades, tanto con fines comerciales como de investigación, es su producción recombinante en células bacterianas. La mayoría de las proteínas recombinantes así sintetizadas son mantenidas en el citoplasma, siendo la ruptura celular un paso necesario para lograr su recuperación. Existen diversos métodos para romper células bacterianas a partir de suspensiones celulares, como ultrasonido, cambios bruscos de presión, congelamiento/descongelamiento, etc. Sin embargo, tratamientos severos con estos métodos pueden generar condiciones desfavorables que podrían conducir a la desnaturalización proteica, lo que representa un problema cuando las proteínas recombinantes se quieren obtener con alto grado de pureza. Por ejemplo, las chaperonas celulares endógenas que se unen y asisten al correcto plegamiento de proteínas mal plegadas, también son liberadas durante la ruptura celular y pueden fijarse y mantenerse unidas con gran afinidad a las proteínas recombinantes de interés dañadas a lo largo de toda su purificación, llevando a su inevitable contaminación. El objetivo de nuestro trabajo fue estudiar el efecto de distintos métodos y protocolos de ruptura celular sobre la calidad de la purificación de proteínas recombinantes sintetizados en células de Escherichia coli. Para ello, las proteínas de cloroplastos de Arabidopsis thaliana cpHsp70s1 y AtClpB3 fueron expresadas en células de E. coli BL21(DE3) fusionadas a colas de Histidina (plásmido pET28 y pET-TEV, respectivamente). Luego, las células fueron cosechadas por centrifugación, resuspendidas en un medio adecuado y sometidas a los siguientes protocolos de ruptura celular en frío: A- ultrasonido empleando un sonicador Cole Parmer de 750 watts: 2, 4, 8 y 10 pulsos de 10 segundos; 1, 5, 10 y 15 pulsos de 15 segundos ó 3, 8 y 15 pulsos de 20 segundos; B- ruptura celular con French Press (SLM-Amico): 1 ó 2 pasadas a 2.000 psi y; C- homogeneización con alta presión en EmulsiFlex-C3 (Avestin): 1 ó 2 pasadas a 15.000 psi. Para cada condición ensayada se obtuvo el extracto celular soluble por centrifugación a 20.000 g (4 ºC), y las proteínas recombinantes cpHsp70 o AtClpB3 se purificaron en batch por afinidad empleando resina de Ni-NTA agarosa (Qiagen). La calidad de cada purificación se analizó por SDS-PAGE (10 g proteínas totales) y tinción Coomassie Blue determinando el número e intensidad relativa de las bandas proteicas obtenidas mediante software. Nuestros resultados mostraron que los tres métodos de ruptura celular ensayados produjeron patrones de bandas con intensidades relativas similares en las purificaciones de cualquiera de las dos proteínas expresadas. Además, el aumento del número de ciclos de sonicado o de pasajes por la French Press o EmuliFlex-C3 para mejorar la ruptura celular, no provocó diferencias significativas en los patrones e intensidades de las bandas proteicas resultantes en las purificaciones. De este modo se podría concluir que el método de ruptura celular seleccionado si se utiliza dentro de parámetros apropiados no tiene efecto apreciable sobre la calidad final de la purificación de proteínas recombinantes sintetizadas en E. coli. Más aún, se puede concluir que la severidad del protocolo de ruptura celular impactaría en el rendimiento final de las proteínas recombinantes obtenidas, pero no lo haría significativamente en la calidad de las mismas.