Estudio de la glicosilación de la flagelina de Ralstonia solanacearum

ORELLANO EG; TONDO ML; LANDONI M; COUTO A

Potrero de los Funes, San Luis.

Simposio; XXI Simposio Nacional de Química Orgánica (SAIQO); 2017

La determinación estructural de los glicoconjugados de diferentes organismos es una tarea compleja debido a la gran variabilidad de estructuras posibles. Una de las herramientas más empleadas en los últimos tiempos para el estudio de los glicoconjugados es la espectrometría de masa acoplada a cromatografía líquida (HPLC-ESI-MS), debido a la posibilidad de analizar mezclas complejas que son parcialmente separadas en la cromatografía sumado al modo de ionización suave que permite obtener señales para los compuestos sin que sufran fragmentaciones. Este último hecho junto con la posibilidad de realizar espectrometría de masa tándem permite obtener una gran información estructural de los analitos en cuestión. Esta técnica se ha convertido en el método más apropiado para la caracterización de pequeñas cantidades de muestra y la determinación de modificaciones discretas pero esenciales.Ralstonia solanacearum es una bacteria Gram-negativa del suelo patógena de una gran variedad de plantas. Es la causante de la marchitez bacteriana o podredumbre parda, que constituye la enfermedad bacteriana más importante de las plantas de papa en las regiones cálidas del mundo y con frecuencia restringe la producción de este cultivo. En este trabajo se comenzó el estudio estructural de la flagelina de R. solanacearum. A partir de una preparación de flagelina de la bacteria separada por SDS-PAGE, se levantó la banda de interés y se realizó la tripsinización in-gel para identificar fehacientemente la proteína en estudio por HPLC-ESI-EM. En una siguiente digestión enzimática se realizó la purificación por HILIC de los posibles glicopéptidos existentes, seguido de su análisis por ESI-Orbitrap-EM. Para la determinación de la existencia de glicopéptidos tanto N- como O-glicosilados se buscaron los iones reporteros correspondientes a los iones oxonio de hexosa (m/z=163.06) y de N-acetilhexosamina (m/z=204.09) y los mismos con pérdida de agua. Mediante esta metodología pudieron determinarse diferentes familias de iones que contienen en su estructura los azúcares. Conociendo la secuencia de la proteína y haciendo los cálculos correspondientes se pudo asignar las señales observadas al péptido 201ASLGAQQSGLASTINTLTSNNTALSAAKSTLIDTDYASETSNMTR245, conteniendo NAcGlc-NAcGlc-Man3-NAcGlc3-Hex1-3. Las señales corresponden al ión [M + 2H2O + Na+ + 5H+]+6. Los valores obtenidos y los calculados para las estructuras conteniendo 1, 2 y 3 hexosas fueron 1050.4947 +6; 1050.4798 +6; 1077.0097 +6, 1077.4887 +6 y 1104.3560 +6, 1104.4975 +6 respectivamente. Posteriormente, se realizó una digestión enzimática utilizando PNGasa F de la banda de gel correspondiente y la presencia de N-glicanos liberados fue corroborada mediante análisis por HPAEC-PAD y EM-UV-MALDI-TOF.Paralelamente, el análisis por HPAEC-PAD de los O-glicanos obtenidos mediante una b-eliminación reductiva de la proteína revela la presencia de una cadena principal formada por 14 hexosas, mientras que la hidrólisis total de los mismos analizada por HPAEC-PAD indicaría que la galactosa está presente en forma mayoritaria.