Generación y caracterización de mutantes de DesK de Bacillus subtilis que se autofosforilen en distintos rangos de temperatura

DIEGO DE MENDOZA; MARIA CECILIA MANSILLA; FLORENCIA TORRESI

Rosario

Jornada; XI Jornada de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Rosario; 2017

UNR

Elmecanismo de adaptación al frío mejor caracterizado hasta el momento enbacterias es el circuito Des de B. subtilis. Esta vía regula laexpresión del gen des que codifica para la ∆5-desaturasa y responde a undescenso en la fluidez de membrana. Está regulada por un sistema detransducción de señales de dos componentes, constituido por una quinasaintegral de membrana, DesK, y un regulador de respuesta soluble, DesR. DesK esuna histidina quinasa con un dominio sensor N-terminal, compuesto por 5segmentos transmembrana (residuos 1 a 153) y un dominio catalíticocitoplasmático C-terminal, denominado DesKC (residuos 154 a 370). DesK tieneactividades quinasa, fosfatasa y fosfotransferasa. En la estructura cristalográficade DesKC en el estado fosfatasa se reconoce un motivo coiled-coil (2-HCC) queno se observa en la conformación auto-quinasa. El modelo actual de transmisiónde señal sugiere que la formación reversible del 2-HCC regula el balance de lasactividades fosfatasa y auto-quinasa de DesK. Así, a 37°C, cuando la membranase encuentra en estado fluido, DesK puede formar el coiled-coil estable y seencuentra en estado fosfatasa dominante y cuando disminuye la temperatura a25°C, la membrana pierde fluidez, el dominio coiled-coil se desestabiliza yDesK adquiere un estado auto-quinasa.Con el objetivo de generar untermosensor bacteriano capaz de adoptar un estado auto-quinasa a temperaturasmás bajas, se realizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida en la zonadel 2-HCC de DesK, tratando de generar un coiled-coil más estable pero capaz deresponder a una señal de frío más intensa. Mediante overlap-PCR se introdujeronresiduos hidrofóbicos en posiciones clave en la interacción entre las hélices(R157I, S153L-R157I, S150I, S122I-S150I, 157I-L174P y S122I). Para evaluar laactividad quinasa de las mismas se expresó cada una de las variantes bajo unpromotor inducible por xilosa (Pxyl)en la cepa DAK3 de B. subtilis, lacual es nula en DesK (desK-)y contiene una fusión transcripcional del promotor de la desaturasa al gen lacZ (Pdes-lacZ) en el locus amyE.Para evaluar la actividad fosfatasa las variantes fueron expresadas en la cepaAKP20 (desKR- Pkan-desR Pdes-lacZ), que expresa altas concentraciones del regulador DesR. Losresultados de las medidas de actividad β-galactosidasa en estas cepas mostraronque la expresión de las variantes DesKR157I y DesKS153L-R157I no presentaronactividad autoquinasa a 25°C, 20°C o 15°C, y se comprobó que ambas manifiestanactividad fosfatasa dominante. Las actividades auto-quinasa y fosfatasa de lasotras cuatro variantes están en proceso de evaluación.En este trabajo se pudo demostrarque la introducción de un solo residuo hidrofóbico (Isoleucina), en la posición157 de DesK permite estabilizar el coiled-coil, de manera tal que se favorecela actividad fosfatasa de DesK, impidiendo toda actividad auto-quinasa aún amuy bajas temperaturas.