Sperm binding to the oviduct for reservoir formation involves scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) domains of the glycoprotein deleted in malignant brain tumor 1 (dmbt1)

ROLDÁN, MARÍA LORENA; MARINI, PATRICIA ESTELA; RUIZ ALVAREZ, JIMENA INÉS; TEIJEIRO JUAN MANUEL

CABA

Congreso; Reunión Conjunta de Sociedades de Biociencias; 2017

SAIC

La proteína Deleted in Malignant Brain Tumor 1 (DMBT1) ha sido descripta tanto en oviducto porcino como humano. Al menos en cerdo, presenta una forma en la luz del órgano, y otra en la membrana apical de las células epiteliales. Esta última participa de la unión de espermatozoides para la formación del reservorio, donde los mismos permanecen en forma quiescente hasta el momento de la ovulación. DMBT1 está formada por varios dominios: Scavenger Receptor Cysteine-Rich (SRCR), CUB y Zona Pelucida (ZP). Para todos ellos se ha descrito capacidad de unir específicamente diferentes células y proteínas. Asimismo, DMBT1 es una glicoproteína que expone Galβ1-3GalNAc, y existe consenso acerca del reconocimiento de hidratos de carbono del oviducto por parte de los espermatozoides. El objetivo de este trabajo es determinar cuál/es de los dominios de DMBT1 está involucrado en la unión de espermatozoides para la formación del reservorio. A tal fin se utilizó un ensayo in vitro de unión de espermatozoides porcinos a células oviductales y su inhibición por anticuerpos específicos para los diversos dominios. Se utilizaron anticuerpos específicos contra el dominio SRCR. Para desarrollarlos se clonó el ADNc correspondiente a la fracción de aa 203-689 de DMBT1 con fusión a poliHis, se expresó en E. coli, purificó y utilizó como inmunógeno. Se utilizaron además anticuerpos anti-CUB desarrollados de manera similar en trabajos anteriores, contra el fragmento de aa 578-803, y anticuerpos anti-ZP desarrollados contra ZP aislada de ovocitos porcinos. Se realizaron cultivos primarios de células epiteliales de oviducto porcino, los cuales se trataron con diluciones de los anticuerpos específicos y suero preinmune. Posteriormente se agregaron espermatozoides, se lavó exhaustivamente y se contó el número de espermatozoides unidos (quintuplicado). Los resultados se expresaron como relación de espermatozoides unidos en presencia de anticuerpo/ espermatozoides unidos en presencia de suero preinmune; y en porcentaje con respecto al grupo control (ausencia de suero). Los supuestos se determinaron a través del gráfico Q-Q plot. Cuando no se cumplió la suposición de varianza constante, se ajustó la heterogeneidad de los errores. Las comparaciones múltiples se realizaron mediante el test LSD Fisher, software infoSTAT. Solamente los anticuerpos anti-SRCR produjeron inhibición de la unión (41%, p