OBTENCIÓN DE APTÁMEROS DIRIGIDOS CONTRA LA PROTEÍNA E6 DE HPV DE ALTO RIESGO ONCOGENICO

FEDERICO MARZIALI; ADRIANA A. GIRI; DIEGO CHOUHY; DANIELA GARDIOL; ELISA M. BOLATTI

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Está firmemente establecido que la infección con el virus papiloma humano de alto riesgo oncogénico (HPV-AR) es el evento clave en el desarrollo del cáncer cervical. La sobre-expresión de los oncogenes E6 y E7 de los HPV-AR es estrictamente requerida para que ocurra la progresión a malignidad. Por lo tanto, la detección del ARNm o las oncoproteínas E6/E7 son una alternativa de mayor especificidad clínica respecto a la detección del ADN viral. El objetivo general de este trabajo es el desarrollo de una nueva metodología de detección de las oncoproteínas E6 de HPV-AR utilizando aptámeros como sensores moleculares. Los aptámeros son moléculas de ADN o ARN simple hebra con una estructura tridimensional determinada que pueden unirse con alta afinidad y especificidad a un amplio rango de moléculas blanco. Los aptámeros se generan a partir de bibliotecas combinatorias de oligonucleótidos mediante un proceso de selección in vitro denominado SELEX, el cual consta de rondas sucesivas de selección negativa, selección positiva (utilizando el blanco molecular deseado), amplificación por PCR, y obtención de ADN simple hebra, para obtener un pool enriquecido de aptámeros. Se realizaron 10 ciclos SELEX utilizando como blanco molecular el fragmento amino terminal (Esfera-GST-E6N) y carboxilo terminal (Esfera-GST-E6CPDZ) de la proteína E6 del HPV16 unidas a esferas de Sefarosa como soporte sólido. El enriquecimiento de aptámeros afines (marcados con FAM) por los blancos moleculares se realizó por citometría de flujo, obteniéndose incrementos de intensidad de fluorescencia en las Esfera-GST-E6N (pool de aptámeros APTE6N) y Esfera-GST-E6CPDZ (pool de aptámeros APTE6CPDZ) sin observarse fluorescencia en el control negativo (Esfera-GST). Estos resultados sugieren una unión específica de los aptámeros a la proteína E6 de HPV16. Posteriormente se procedió al clonado del pool de aptámeros APTE6CPDZ con el objetivo de identificar una sola secuencia capaz de unirse a la proteína E6. Se identificaron 8 grupos de aptámeros en base a homología de secuencias y se seleccionó un aptámero en particular (APTE6CPDZ_9) para continuar los experimentos. La constante de disociación (Kd) obtenida para este aptámero fue Kd=37.24 nM, la cual es adecuada para continuar caracterizando este aptámero. Luego se analizaron 12 muestras clínicas de cepillados endo/exocervical mediante microscopia confocal, 6 de ellas HPV16 positivas y 6 HPV16 negativas, utilizando el aptámero APTE6CPDZ_9. En una de las muestras HPV16 positivas se observó una fuerte marca nuclear debida probablemente a una sobreexpresión de la oncoproteína E6. En ninguna de las muestras negativas se observó fluorescencia nuclear. En conclusión, los resultados preliminares mostraron la obtención de un aptámero (APTE6CPDZ_9) dirigido contra la proteína E6 de HPV16 con una constante de disociación en el orden nanomolar y capaz de identificar células infectadas por HPV16.