Desarrollo de ensayos para el diagnóstico molecular de virus de importancia clínica.

PEREZ, G. R.; CHOUHY, DIEGO; BELINKY, J.J.; TABORDA, MIGUEL A.; GIRI ADRIANA ANGELICA

Rosario

Congreso; IV Expo Congreso Bioquímico; 2008

Colegio de Bioquímicos de la provincia de Santa Fe

<!-- /* Font Definitions */ @font-face {font-family:"MS Mincho"; panose-1:2 2 6 9 4 2 5 8 3 4; mso-font-alt:"ＭＳ 明朝"; mso-font-charset:128; mso-generic-font-family:modern; mso-font-pitch:fixed; mso-font-signature:-1610612033 1757936891 16 0 131231 0;} @font-face {font-family:"@MS Mincho"; panose-1:2 2 6 9 4 2 5 8 3 4; mso-font-charset:128; mso-generic-font-family:modern; mso-font-pitch:fixed; mso-font-signature:-1610612033 1757936891 16 0 131231 0;} /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"MS Mincho"; mso-fareast-language:JA;} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> Los ensayos basados en la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) son instrumentos fundamentales para la detección de virus en muestras biológicas debido a su alta sensibilidad, especificidad y rapidez. Sin embargo, es necesario incluir Controles Internos (CI) a fin de monitorear todas las etapas del ensayo (extracción, amplificación y detección) y asegurar la calidad del resultado. Para ello, el CI debe presentar características similares al virus blanco y agregarse a la muestra previamente a su procesamiento. En este trabajo se desarrollaron ensayos moleculares con CI no competitivos y aplicables al diagnóstico de virus con genoma ADN y ARN. Para ello, se seleccionaron el fago PI (genoma de ADN) y el fago Qb (genoma de ARN) como CI. El fago P1 se propagó y tituló utilizando E. coli RecA+ W3110. El Fago Qb se obtuvo por inducción de células E. coli BL21pLys transformadas con el plásmido pBRT7Qb que contiene el genoma fágico como ADNc bajo el control del promotor T7 y se tituló con E. coli XL1Blue F’. Se diseñaron cebadores y sondas específicos para cada fago. Se optimizaron las reacciones de co-amplificación e hibridación correspondientes a diferentes virus blanco con genoma de ADN (Herpes Virus Simples I/II, Citomegalovirus, Virus Epstein-Barr, Adenovirus) o de ARN (enterovirus) utilizando el fago PI o Qb como CI, respectivamente. La optimización se efectuó con ensayos de RCP (o transcripción reversa-RCP), seguidos de hibridización líquida con sondas no radioactivas y detección colorimétrica, previamente desarrollados en nuestro laboratorio. Los ensayos resultantes se utilizaron para analizar 161 muestras (32 sueros, 94 LCR, 20 orinas, 4 biopsias, 7 médulas óseas y 4 separaciones leucocitarias) provenientes de distintos servicios hospitalarios de Rosario. En conclusión, la incorporación de los fagos P1 y Qb como CI en ensayos moleculares es una estrategia efectiva para resolver resultados falsamente negativos causados por inhibición o deficiencias en el proceso de extracción de los ácidos nucleicos de la muestra clínica.