Análisis molecular del proceso de oxidación de manganeso (II) en nuevos aislados bacterianos

AINELEN PIAZZA; JORGELINA OTTADO; CIANCIO, L.; GOTTIG, N.

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología; 2016

La presencia de altas concentraciones de Mn (II) en aguas subterráneas de consumo humano es un problema ampliamente distribuido enArgentina y en el mundo, ya que afecta su calidad desde el punto de vista de aceptabilidad, operativo y sanitario. Durante los últimos años, losmétodos de remoción biológica han adquirido una mayor relevancia debido a la alta eficiencia, bajo costo e impacto ambiental negativo. Ennuestro laboratorio, con el fin de mejorar estos procesos, se aislaron y seleccionaron bacterias con una alta capacidad de oxidar Mn. En estetrabajo se propone estudiar los mecanismos moleculares de oxidación del Mn utilizados por estas bacterias aisladas.Para poder identificar proteínas implicadas en la oxidación de Mn (II), se diseñaron tres estrategias. Por un lado, se pusieron a punto ensayos deactividad en gel. A partir de extractos proteicos totales de las cepas bacterianas aisladas crecidas en presencia de Mn (II) se corrieron gelesnativos. Los mismos se incubaron con Mn (II) y, las proteínas capaces de oxidarlo, se evidenciaron como bandas que presentaron un precipitadomarrón debido a los óxidos de Mn que se formaron. Las bandas con actividad positiva se cortaron del gel y se enviaron a identificar por mediode MALDI‐TOF.Hasta el momento se han identificado dos tipos de enzimas con capacidad de oxidar Mn (II): las enzimas llamadas Multicobre oxidasas (MCO) ylas Hemo‐peroxidasas de unión a calcio. Por esto, otra metodología aplicada consistió en el diseño de oligonucleótidos degenerados a partir delas secuencias de estas Mn Oxidasas ya conocidas. Con estos oligonucleótidos se realizaron reacciones de PCR con ADN de los distintos aisladosbacterianos. La secuenciación de estos genes nos permitirá detectar la presencia o no de estos tipos de oxidasas y además caracterizar a lasmismas en cada uno de los géneros evaluados.Finalmente, con el fin de identificar Mn oxidasas de especies microbianas cultivables y no cultivables, se construyó una bibliotecametagenómica funcional. Para esto, se preparó ADN a partir de muestras ambientales con alto contenido de Mn (II) que se digirió y clonó en elvector pUC18. La mezcla de ligación se transformó en E. coli DH5α y se seleccionaron los transformantes que contienen fragmentos de ADNclonados. Con el fin de identificar genes involucrados en la oxidación de Mn se puso a punto un ensayo de actividad in vitro utilizando elcolorante Azul de Leucoberbelina, que en presencia de óxidos de Mn es oxidado produciendo un color azul, con un máximo de absorción a 618nm.Todos los resultados que se obtengan de estos análisis ampliarán los conocimientos básicos de la biogeoquímica del Mn y de los mecanismosmoleculares utilizados por las bacterias para oxidar metales y para adaptarse a la presencia de altas concentraciones de los mismos.