Clonado y caracterización de una 4-Esfingolípido Desaturasa (D4-SphDes) de Trypanosoma brucei

VACCHINA P.; ROSSO C.; TRIPODI K.; UTTARO A.

Rosario, Santa Fe, Argentina

Congreso; VIII Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2008

Sociedad Argentina de Protozoología

Los esfingolípidos constituyen un grupo de lípidos con diversas funciones en la interacción celular, la apoptosis y la proliferación celular, entre otras. Están constituidos por bases esfingoides (LCBs), definidas como 1,3-dihidroxi-2 aminoalcanos; un ácido graso en unión amida y una cabeza polar en C1. Las LCBs más abundantes poseen 18C, y pueden ser saturadas (DHS, dihidroesfingosina), insaturadas (Sph, esfingosina) o hidroxiladas (PSph, fitoesfingosina). La desaturación en posición 4 es llevada a  cabo por una D4-SphDes, enzima que posee las cajas de histidina conservadas en otras desaturasas y no presenta dominio cit b5. Algunas de estas enzimas pueden presentar también actividad D4-hidroxilasa, es decir que son bifuncionales. En el genoma de Trypanosoma cruzi se han detectado tres secuencias de posibles D4-SphDes, dos de las cuales aparecen truncadas y una como pseudogen. La secuencia restante Tc00.1047053510565.20 (GeneDB) fue seleccionada para su estudio, la misma mostró un 53,9 % identidad de con la enzima de T. brucei y 37 % con la de Schyzosaccaromyces pombe. Se llevó a cabo el clonado en el vector pYES2 (Invitrogen), inducible por galactosa, y se estudió la expresión de actividad mediante la caracterización de las esfingobases sintetizadas en una levadura mutante para la actividad hidroxilasa (sur2), única LCB presente en S. cerevisiae.  Los cultivos fueron crecidos cinco días a 30ºC e incubados a 37ºC durante 90 min antes de ser recolectados, para inducir la expresión total de esfingolípidos. Luego de la extracción básica directa de las LCBs, la síntesis de derivados DNP y la separación de los mismos en TLC,  se removieron las muestras de la sílica y se extrajeron para separarlas por HPLC en una columna de fase reversa. Las identidades de los picos eluidos fueron asignadas por comparación con los tiempos de retención de estándares (Sigma). Fue posible detectar la presencia de esfingosina (LCB 18:1) pero no de fitoesfingosina (LCB hidroxilada), por lo cual concluimos que la secuencia corresponde a una D4-SphDes y no es bifuncional. Por otra parte, realizamos la caracterización de las bases esfingoides totales presentes en cultivos de epimastigotes de T. cruzi CL Brener. Los resultados mostraron que las LCBs más abundantes son la DHS y la Sph de 18C, mientras que los niveles de  DHS de 20C fueron bajos y no se detectó PSph. Este perfil concuerda con la actividad caracterizada por expresión heteróloga en levaduras. Además se estudiaron el efecto del tiempo de incubación a 37ºC y del agregado de serina al medio de cultivo, ambos factores descriptos como inductores de la síntesis total de esfingolípidos (ref). Mientras se estableció que a luego de 90 min a 37ºC el contenido total de LCBs se incrementó en un 20% con respecto a los niveles a 30ºC, la serina no tuvo efecto significativo. Se discute el rol de los esfingolípidos y su estado de insaturación en las membranas de T. cruzi.