Búsqueda de nuevas proteínas involucradas en la oxidación de manganeso (II).

PIAZZA A; CIANCIO L; OTTADO J; GOTTIG N

Congreso; III Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2015

Las bacterias oxidantes de Manganeso (Mn) son filogenéticamente diversas y generalmente se encuentran en ambientes versátiles tales como el suelo, las aguas naturales y sedimentos. Hasta el momento se han identificado dos tipos de enzimas con capacidad de oxidar Mn (II): las enzimas llamadas Multicobre oxidasas (MCO), que son una familia de proteínas que unen cobre y que tienen la capacidad de oxidar distintos sustratos, y las Hemo-peroxidasas de unión a calcio. Sin embargo, no se han realizado estudios exhaustivos para identificar proteínas involucradas en los procesos de biooxidación, transporte y metabolismo de este metal. Asimismo, existen pocos estudios de los mecanismos moleculares utilizados en estos procesos por bacterias aisladas de zonas con alta concentración de Mn.En estudios previos realizados en nuestro laboratorio se seleccionó y aisló una bacteria oxidante de Mn a partir de muestras ambientales, identificada como Pseudomonas resinovorans. El género Pseudomonas representa un sistema modelo, ideal para el estudio de la fisiología y mecanismo de oxidación de Mn (II), debido a la facilidad de crecimiento y manipulación en condiciones estándar de laboratorio. En este trabajo se propone identificar nuevas proteínas involucradas en la oxidación de Mn (II), a partir del estudio de dicho aislamiento bacteriano. Para ello, se realizaron ensayos que permiten verificar actividad oxidante de Mn por PAGE nativo, ensayo de oxidación in gel in situ. Se sembró la fracción de proteínas solubles intracelulares y solubles secretadas de la cepa de interés en geles de poliacrilamida 8%. Luego de la electroforesis, los geles fueron incubados por 30 minutos en un buffer (pH 7.5; 0.5% Triton X-100,10% [v/v] glicerol) y posteriormente en HEPES 10 mM (pH 7.5; 200 μM MnCl2 y CuSO4). El proceso de oxidación pudo seguirse visualmente mediante la aparición de bandas de óxidos de Mn de color marrón en el gel, las cuales aparecen usualmente luego de 24 h de incubación a 37°C. Posteriormente, para verificar que las bandas observadas efectivamente correspondían a óxidos de Mn, se incubó el gel con Leucoberbelina, un compuesto que en presencia de Mn (III o IV) se oxida, produciendo un color azul. Se pudo detectar una banda de oxidación de Mn en la fracción de proteínas solubles secretadas de la bacteria analizada. El análisis posterior de la banda por nanoHPLC-ESI-Orbitrap permitirá la identificación de la proteína responsable de la oxidación. Por otro lado, se puso a punto un ensayo colorimétrico con leucoberbelina, que permite cuantificar la capacidad de oxidación de Mn (II). Este trabajo contribuirá al entendimiento del proceso de oxidación de Mn (II) en Pseudomonas resinovorans y además este estudio podrá extrapolarse a otro tipo de bacterias.