Diseño y optimización de un método cinético sencillo, basado en un ciclo catalítico de sustrato para determinar concentraciones submicromolares de AT(D)P

MARIÁNGELES RICO; ANABELLA F. LODEYRO; OSCAR A. ROVERI

La Plata- Argentina

Congreso; XXXVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2008

Sociedad Argentina de Biofísica

La necesidad de contar con un método sensible y sencillo para la determinación de concentraciones submicromolares de AT(D)P como ligandos de proteínas o como reactivos y/o contaminantes de medios utilizados en el estudio cinético de reacciones enzimáticas, nos llevó a diseñar y optimizar un método cinético, espectrofotométrico, basado en un ciclo catalítico de sustrato. El método consiste en determinar la velocidad de un  ciclo catalítico de sustrato constituido por hexoquinasa y piruvatoquinasa. El ciclo produce glucosa-6-fosfato y piruvato a velocidad constante en el estado estacionario, la cual es directamente proporcional a la suma de las concentraciones de ATP y ADP. Si se acopla lactato deshidrogenasa al ciclo catalítico como enzima monitora, la concentración de piruvato se mantendrá en estado estacionario y será función de la [AT(D)P] y el consumo de NADH (medido a 340 nm) será una buena estimación de la velocidad del ciclo. El estudio de la dependencia de la velocidad del ciclo en presencia de concentraciones constantes y submicromolares de ATP permitió establecer las concentraciones de los cosustratos del ciclo (glucosa: 1 mM y fosfoenolpiruvato: 2 mM) y del catión activador (MgCl2: 2 mM) óptimas para la reacción. Se estudió la dependencia de la velocidad del ciclo catalítico con las concentraciones de piruvato quinasa (PK) y hexoquinasa (HK).  Se observaron dependencias hiperbólicas de la velocidad del ciclo catalítico con la concentración de cada una de las quinasas cuando se mantiene constante la concentración de la otra, de acuerdo al comportamiento teóricamente previsto. En resumen, la sensibilidad del método depende de la concentración de las quinasas. Sin embargo, la presencia de ATP y/o ADP como contaminantes en el medio de reacción, establece un límite práctico para la sensibilidad de método.  En nuestro caso, la única causa de contaminación del medio de reacción con ATP o ADP fue el NADH comercial, el que contenía 2.26 nmol A(T+D)P/mmol NADH. En conclusión, el método desarrollado es un método de operatoria muy sencilla, requiere de equipamiento existente en cualquier laboratorio y permite la determinación de concentraciones submicromolares de ATP+ADP. <!-- /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} -->