Las HMGBs de tripanosomas presentan un dominio adicional de interacción con el ADN

NARANJO SOFÍA; CRIBB PAMELA; ALONSO, VICTORIA LUCÍA; RITAGLIATI, CARLA; SERRA, ESTEBAN

Rosario

Congreso; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Portozoología; 2013

Sociedad Argentina de Portozoología

Las proteínas HMG (High Mobility Group) constituyen una superfamilia de proteínas que llevan a cabo diversas funciones nucleares a través del remodelado de la estructura de la cromatina. Se caracterizan por la presencia de uno o más dominios de unión al ADN ?HMG box?, que reconocen y se unen a estructuras distorsionadas del ADN como ADN cruciforme y minicírculos al igual que la proteína HMGB1 de animales, pero en lugar de la región acídica carboxilo terminal presente en la mayoría de las HMGBs, TcHMGB posee una región amino terminal exclusiva de las HMGBs de tripanosomátidos. Realizando estudios in silico, encontramos que dicha secuencia amino terminal contendría una señal de localización nuclear (NLS) y un dominio ?DEK-C? de unión al ADN. Por ensayos de retardo en gel y de circularización por T4 ligasa, hemos probado que la proteína tiene la capacidad de unir ADN cruciforme, así como también doblar ADN lineal. Esta interacción con el ADN, es dependiente de la estructura y no de la secuencia del ADN. Dado que Trypanosoma cruzi no presenta promotores canónicos, ni factores generales de la transcripción clásicos de otros eucariotas, consideramos que la regulación epigenética sería clave para regular el inicio de la transcripción en estos parásitos. Para realizar un estudio más exhaustivo de la proteína TcHMGB, con especial atención en la región amino terminal que la diferencia de su homóloga en el hombre, se clonaron los fragmentos NLS, DEK y la región amino terminal completa en el vector de entrada pENTR-3C para luego ser transferidos (por una reacción de recombinación LR clonasa de Invitrogen) al vector de destino pDEST17 que permite obtener los distintos fragmentos fusionados a una cola de Histidinas. Posteriormente efectuamos la expresión y purificación de la construcción N-terminal fusionada a His, la cual se expresó mayoritariamente de forma insoluble. De esta manera, proseguimos a clonar las distintas versiones de la proteína truncada como fusiones a la proteína Glutatión S Transferasa (GST) utilizando el vector pGEX-3X-GW. Con esta nueva estrategia se intenta obtener las proteínas recombinantes en condiciones solubles, para luego efectuar los ensayos de unión al ADN in vitro similares a los realizados con la proteína entera y poder inferir alguna función de esta región amino terminal. Por otro lado, también estamos clonando los distintos dominios en el vector de expresión en T.cruzi (pTEX-e-GFP) para expresar fusiones a la proteína verde fluorescente (GFP) que permitirán observar la localización subcelular en el parásito. Así evaluaremos si la señal de localización nuclear predicha por métodos bioinformáticos es funcional en el parásito, es decir si la NLS es necesaria y suficiente para dirigir la proteína al núcleo.