Estudio de la regulacion de las distintas isoformas de la enzima CT en lineas celulares de neuronas y testiculo

HEBE MARCUCCI; PAOLA GILARDONI; CLAUDIA BANCHIO

No Informado

Congreso; Sociedad de Biologia de Rosario; 2006

SBR

 La síntesis de fosfatidilcolina (PC), el fosfolípido más abundante de las membranas, ocurre en todas las células nucleadas a través de la ruta de Kennedy, donde el paso limitantante es catalizado por la enzima CTP:fosfocolina citidil transferasa (CT). Se han identificado dos isoformas de dicha enzima: CTa  y CTb. La primera es la isoforma mayoritaria en todos los tejidos, mienstras que CTb se expresa como dos transcriptos (CTb2 y CTb3) principalmente en tejido neural, testicular y ovario de ratón. El  objetivo del presente proyecto es estudiar la expresión y regulación  de las  isoformas  CTb2 y CTb3, durante la diferenciación de líneas celulares Neuro2A (neuroblastomas de ratón)  y en células Sertoli TM4 (células somáticas de testículo de ratón). Se construyeron fusiones transcripcionales entre los promotores de ambas isoformas de CTb y el gen reportero Luciferasa. Se transfectaron células Sertoli TM4 y Neuro2A no diferenciadas y diferenciadas con ácido retinoico (RA). Los  resultados indican que CTb es activa en células Sertoli. Se observó un incremento en la expresión de CTb2  luego de diferenciar las células neuronales con RA (n=3). En una cuantificación relativa de  RNAm de CTb2 y CTb3 mediante Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR), se detectó mayor expresión de CTb2 en células Neuro2A diferenciadas respecto a las no tratadas con RA, mientras que los niveles de expresión de CTb3 no fueron apreciables (n=3). En células Sertoli, se observó sólo expresión de la isoforma CTb2. Para mapear de forma aproximada el sitio de inicio de la transcripción  de ambos transcriptos, se realizaron deleciones 5´ del promotor  fusionadas al gen reportero Luciferasa, y ensayos de extensión del cebador. Para identificar el o los factores transcripcionales que regulan la expresión de las isoformas de CTb,  se efectuaron ensayos de retardo en gel (EMSA) en presencia de anticuerpos específicos (Super Shift),  empleando extractos nucleares de células Sertoli y Neuro2A diferenciadas y sin tratamiento con RA. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que las isoformas CTb2 y CTb3 podrían cumplir roles  específicos, no superpuestos,  en el proceso de diferenciación neural y  durante la proliferación de células Sertoli de ratón.