Estudio de proteínas regulatorias del sistema de secreción tipo tres del fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri

GAROFALO CG; OTTADO J; GOTTIG N

Rosario

Jornada; Jornadas de Ciencia y Tecnología- Rosario 2011; 2011

La cancrosis de los cítricos, es una enfermedad causada por la bacteria fitopatógena Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Xac, al igual que otros patógenos Gram-negativos, utiliza el sistema de secreción de proteínas tipo III (SSTT) para transportar proteínas efectoras al interior de la célula vegetal hospedadora. El cluster que codifica el SSTT se denomina hrp y es necesario para la respuesta hipersensible (HR) y patogenicidad. Los genes hrp se inducen in planta y en medios de cultivo mínimos a través de dos proteínas regulatorias, HrpG y HrpX. HrpG es homóloga a proteínas reguladoras de respuesta de la familia OmpR de sistemas de dos componentes y es necesaria para la activación transcripcional de todos los genes hrp. Con el objetivo de estudiar el rol que cumple la proteína regulatoria HrpG de Xac durante la cancrosis de los cítricos construimos una bacteria mutante en el gen que codifica para HrpG (hrpG) por intercambio de marcador que denominamos XacΔhrpG. Esta mutante se infiltró en hojas de plantas de naranja (planta hospedadora) y a diferencia de lo que ocurre con Xac, no fue capaz de causar enfermedad. Cuando esta cepa se inoculó en plantas no hospedadoras de algodón y tomate no se observó respuesta HR en las zonas inoculadas como si ocurre con Xac salvaje. Además se construyó una cepa de Xac que sobreexpresa HrpG mediante la conjugación con un plásmido replicativo que posee el gen hrpG, a la que denominamos XacHrpG+. En este caso el fenotipo de la infección fue similar al de Xac salvaje. Curvas de crecimiento bacteriano in planta mostraron que XachrpG+ tiene un crecimiento similar al de Xac salvaje. A continuación decidimos evaluar la expresión génica de la cepa XachrpG+ y ver si la sobreexpresión de la proteína HrpG modula los niveles de expresión transcripcional del cluster hrp. Para esto, se preparó ARN de cultivos crecidos en medio líquido SB y XVM2 y de bacterias infiltradas en plantas de naranja (expresión de genes bacterianos in planta). Se realizó una RT-PCR usando oligonucleótidos que amplifican el gen del rRNA 16S como control y el gen hrpE, que pertenece al cluster hrp y codifica para una proteína formadora del pilus Hrp. Los resultados muestran que hrpE no se expresa en en el medio rico SB. Sin embargo en el medio XVM2, que es un medio inductor del cluster hrp, se observó expresión del gen hrpE en la cepa salvaje, y en XachrpG+ la inducción fue aún mayor, lo que confirma la regulación transcripcional de hrpE por HrpG. Por otro lado, la expresión de hrpE in planta mostró que el gen hrpE se induce a partir de los 3 dpi y se mantienen los niveles hasta los 6 dpi, indicando que durante la infección Xac es capaz de percibir señales propias o de la planta hospedadora, que inducen la expresión de genes hrp para el ensamblado del SSTT y la translocación de moléculas efectoras que permiten la colonización de la planta y el desarrollo de la enfermedad. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que HrpG es una proteína esencial para expresión de los genes involucrados en el SSTT y por lo tanto para el desarrollo de la cancrosis de los cítricos.