Caracterización estructural y funcional de la proteína sensora/transductora MecR1 de los sistemas de resistencia a los beta-lactámicos de Staphylococcus aureus

SUAREZ, IRINA P.; MIHOVILCEVIC, DAMILA; LLARRULL, LETICIA I.; FABBRI, CAROLINA; HERMOSO, JUAN

Rosario

Jornada; Primeras Jornadas de Ciencia y Tecnología de la FBIOyF, UNR; 2021

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR)

Introducción:Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA, por las siglas en inglés) ha surgidocomo un patógeno de importancia mundial por su resistencia a todas las clases deantibióticos b-lactámicos y, en algunas cepas, su resistencia a glicopéptidos, antibióticos deúltimo recurso utilizados para tratar las infecciones por MRSA. La resistencia a losantibióticos b-lactámicos se debe a la expresión inducible de una transpeptidasa accesoriacon baja afinidad por la mayoría de los b-lactámicos, PBP2a, y de la serin-b-lactamasa PC1.La producción de estas proteínas está regulada por las proteínas sensoras/transductorasMecR1 y BlaR1, respectivamente, en respuesta a la presencia del antibiótico b-lactámico.Sin embargo, los eventos intramoleculares que conducen a la activación de MecR1 y BlaR1son poco conocidos y su estudio se ha visto limitado por la falta de información estructuralde alta resolución sobre las proteínas completas.Resultados:Con el fin de obtener información sobre los detalles moleculares de la activación de MecR1,hemos evaluado la expresión de MecR1 de longitud completa (mutante E205A, que carecede actividad autoproteolítica) como una fusión con la proteína Mistic. Hemos logrado sobreproducirMistic-MecR1 en membranas de E. coli BL21 StarTM (DE3) y purificarla en micelasdel detergente ASB-14 mediante cromatografía de afinidad. Ensayando su capacidad deunir la penicilina fluorescente Bocilina-FL se evidenció al dominio sensor en su estado activoen esta proteína recombinante. Además, hemos obtenido policristales en un primer ensayode cristalogénesis. Intentamos optimizar la condición de cristalización, pero aún no hemoslogrado la formación de cristales individuales.En segundo lugar, la purificación de MecR1.E205A como fusión a Mistic fue re-optimizadaen función de las condiciones requeridas para realizar ensayos de ultracentrifugaciónanalítica y light scattering. Para ello se adicionó un segundo paso de purificación queconsiste en una cromatografía de exclusión molecular permitiendo aumentar la pureza dela muestra. Observamos que al pasar por la columna de exclusión molecular la proteínaeluye en dos picos separados, indicando la presencia de dos especies.Conclusiones:Se logró sobre-producir la proteína MecR1.E205A como fusión a la proteína Mistic y seoptimizó su purificación. Al adicionar un segundo paso de purificación utilizando unacromatografía de exclusión molecular, logramos obtener una muestra más homogénea paracontinuar con técnicas de alta resolución como cristalografía y crio-microscopía electrónica.