CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES POR SOBREEXPRESIÓN DE ALFA-TUBULINA EN TRYPANOSOMA CRUZI

ALONSO, VICTORIA LUCIA; MARTINEZ PERALTA, GONZALO

Zavalla

Congreso; XXIII Congreso y XLI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2021

Sociedad de Biologia de Rosario

La Enfermedad de Chagas (o Tripanosomiasis Americana) es una de las 17 enfermedadestropicales desatendidas listadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS), esendémica en 21 países de América Latina y causa entre 10 y 15 mil muertes por año. Enel presente proyecto se propone caracterizar la función de la α-tubulina acetilada en laremodelación y el mantenimiento del citoesqueleto de T. cruzi (agente causante de dichaenfermedad), un proceso de gran importancia durante los eventos de diferenciacióncelular que acompañan el desarrollo del ciclo de vida del parásito. Nuestro objetivo esestudiar la función de la acetilación de la lisina 40 de α-tubulina de T. cruzi mediante lacaracterización fenotípica de mutantes puntuales. En el laboratorio contábamos concuatro construcciones diferentes del plásmido correspondientes a la α-tubulina salvaje ytres mutantes puntuales en el vector pTcINDEX-GW (permite inducir la expresión en T.cruzi por tetraciclina). Las construcciones se realizaron incorporando un epítope dehemaglutinina (HA) en el extremo N-terminal de la secuencia codificante putativa parala α-tubulina de T. cruzi. Las tres mutantes puntuales se consiguieron intercambiando lalisina 40 por: una arginina (K40R), aminoácido que mantiene la carga positiva pero no esacetilable, una glutamina (K40Q), que por sus características fisicoquímicas mimetiza lalisina, reproduciendo la función de la tubulina acetilada y una alanina (K40A), unaminoácido neutro. Estas construcciones fueron utilizadas para transfectar epimastigotesde T. cruzi y así obtener una línea estable para la versión salvaje. No pudimos detectar lasobreexpresión de la α-tubulina exógena, pero si la del ARNm. La incorporación de“tags” en la tubulina no siempre es exitosa, la mayoría de los estudios in vivo demicrotúbulos se han realizado expresando tubulina marcada a niveles reducidos enpresencia de tubulina endógena. Muchas proteínas toleran un tag en un extremo, pero noen el otro. Cabe destacar que en el extremo C-terminal de esta proteína ocurren diversasmodificaciones post-traduccionales (MPTs). A partir de estos resultados nos propusimosllevar a cabo nuevas transfecciones para las cuatro variantes (salvaje y mutantes), pero apartir de nuevas construcciones incorporando el epítope de HA en el extremo C-terminalen lugar del N-terminal. Tuvimos éxito obteniendo una línea estable que sobreexpresa laα-tubulina para la versión salvaje, lo cual pudimos verificar a través de ensayos dewestern blot y de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HA. A pesar de este logro,los parásitos del control negativo (sin tetraciclina) también expresaron la proteínaexógena, de manera tal que el sistema de sobreexpresión por inducción no estáfuncionando en forma eficiente. Actualmente nos encontramos trabajando en latransfección de las versiones mutantes. Además, nos planteamos como estrategia llevar acabo un ensayo de dilución límite, el cual se basa en diluciones sucesivas de un cultivohasta obtener un único parásito y de esta manera intentar rescatar alguno que se encuentreregulando la sobreexpresión de α-tubulina mediante tetraciclina.