CONSTRUCCIÓN DE MUTANTES POR SOBREEXPRESIÓN DE ALFA-TUBULINA EN TRYPANOSOMA CRUZI

MARTINEZ PERALTA, GONZALO; ALONSO, VICTORIA LUCIA

Rosario

Jornada; XV Jornada de Ciencias y Tecnologías e Innovación de la Universidad Nacional de Rosario; 2021

La acetilación de proteínas se ha revelado en los últimos años como una de las modificaciones postranscripcionales más frecuentes, tanto en bacterias como en células eucariotas. Si bien las bases moleculares de su acción no son completamente conocidas, se ha establecido que modula importantes procesos celulares como la modificación de la estructura de la cromatina, la transcripción, la progresión del ciclo celular, la regulación del metabolismo energético y la remodelación de microtúbulos. En el presente proyecto se propone caracterizar la función de la α-tubulina acetilada en la remodelación y el mantenimiento del citoesqueleto de Trypanosoma cruzi, un proceso de gran importancia durante los eventos de diferenciación celular que acompañan el desarrollo del ciclo de vida del parásito.Se obtuvieron con éxito únicamente transfectantes para la versión salvaje de la α-tubulina. Mediante ensayos de western blot y de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HA no pudimos detectar la sobreexpresión de la α-tubulina exógena, pero si detectamos la sobreexpresión a nivel de ARNm cuando indujimos con tetraciclina (resultados no mostrados). La incorporación de “tags” en la tubulina no siempre es exitosa, la mayoría de los estudios in vivo de microtúbulos se han realizado expresando tubulina marcada a niveles reducidos en presencia de tubulina endógena. Muchas proteínas toleran un tag en un extremo, pero no en el otro. Cabe destacar que en el extremo C-terminal de esta proteína ocurren diversas modificaciones post-traduccionales (MPTs). En base a estos resultados nos propusimos llevar a cabo nuevas transfecciones para las cuatro variantes pero incorporando el epítope de HA en el extremo C-terminal en lugar del N-terminal.tuvimos éxito obteniendo una línea estable de T. cruzi que sobreexpresa la α-tubulina para la versión salvaje. Además, logramos visualizar el tag de HA en el extremo C-terminal de la α-tubulina para una de las cuatro construcciones propuestas. Aunque, los parásitos en la condición sin inducir tambiénexpresaron la α-tubulina exógena.Nos planteamos como estrategia llevar a cabo un ensayo de dilución límite, el cual se basa en diluciones sucesivas de un cultivo hasta obtener un único parásito y de esta manera intentar rescatar un clon que se encuentre regulando la sobreexpresión de α-tubulina mediante tetraciclina.