Enzimas involucradas en la homeostasis energética flagelar de Trypanosoma cruzi

CAMARA MM; BOUVIER LA; MIRANDA MR; PEREIRA CA

Jornada; IX Jornadas Científicas Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari; 2010

Introducción: Las adenilato quinasas (Adk) y las nucleósido difosfatoquinasas (NdPk) son enzimas ampliamente distribuidas en los seresvivos. Las mismas son fosfotransferasas que catalizan la transferenciade fosfatos de alta energía entre los nucleótidos de adenosinamanteniendo la homeostasis intracelular de los mismos y duplicando elpotencial energético del ATP. Usualmente a estas enzimas se lasencuentra asociadas a estructuras subcelulares dedicadas a la síntesiscomo al consumo de ATP. Entre estas últimas podemos destacar a losflagelos de cuya movilidad depende la supervivencia y viabilidad denumerosos organismos tanto de vida libre como parásitos incluyendo aT. cruzi. En tripanosomátidos se han encontrado siete isoformas deadenilato quinasa (TzAdk1-6 y N) y cuatro de nucleósido difosfatoquinasa (TzNdPk1-4). Esto se podría explicar debido a la grandiversidad de condiciones que atraviesan durante su ciclo de vida. Enel presente trabajo caracterizamos las fosfotransferasas flagelaresTzAdk4 y TzNdPk3 de T. cruzi.Objetivos: Comenzar a estudiar las fosfotransferasas especificas deflagelo en T. cruzi.Metodología: Epimastigotes (estadio replicativo no infectivo) deTrypanosoma cruzi de la cepa CL Brener, salvajes o modificadosgenéticamente, se cultivan a 28°C en medio LIT (triptosa de infusión dehígado). Para la localización subcelular de TcAdK3 porinmunofluorescencia, los parásitos se fijan y permeabilizan para luegoincubarlos con el anticuerpo especifico y finalmente con anticuerposecundario asociado a fluoróforos. Como marcadores de localizaciónse utilizarán, colorante DAPI (nuclear) y PAR-2 (proteína estructural dela barra paraflagelar). Para la sobre-expresión de las proteínas deinterés, se construirán modelos de parásitos transgénicos a partir deepimastigotes salvajes. Los parásitos se transfectarán mediante lastécnicas clásicas, utilizando plásmidos completamente diseñados ennuestro laboratorio.CONCLUSION: Resultados y Conclusiones: TzAdk4 y TzNdPk3 fueronclonadas y sobre-expresadas en bacterias purificándose la proteínaobtenida. Mediante ensayos bioquímicos de actividad enzimática, sepudo validar a las mismas como adenilato quinasas y nucleósidodifosfato quinasas respectivamente. Con el objetivo de confirmar sulocalización subcelular se diseñaron plásmidos capaces de sobreexpresar las distintas isoformas fusionadas a la proteína verdefluorescente. Una vez obtenido los parásitos transgénicos se pudieronobservar patrones solubles como flagelares para ambas proteínas.Actualmente se están mapeando las señales responsables de lasdiferentes localizaciones como estudios funcionales de las mismas.