Estudio de dos nucleósido difosfato quinasas de Trypanosoma cruzi , TcNDPK1 y TcNDPK2

MARIANA R. MIRANDA; BOUVIER LEON A; CANEPA GASPAR E; PEREIRA CLAUDIO A

Buenos Aires

Jornada; VII JORNADAS CIENTIFICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MEDICAS ALFREDO LANARI; 2008

Universidad Buenos Aires

INTRODUCCIÓN: Las nucleósido difosfato quinasas (NDPKs) son enzimas ubicuas y muy consevadas en la evolución, que catalizan la transferencia de fosfatos de alta energía desde nucleósidos tri- a difosfato. Están involucradas en el mantenimiento del “pool” de nucleótidos y fueron asociadas a muy diversas funciones celulares. En Trypanosoma cruzi reportamos la presencia de cuatro isoformas de NDPK, dos de las cuales (TcNDPK1 y TcNDPK2) fueron validadas y caracterizadas.   OBJETIVOS: Caracterizar dos isoformas de NDPK de Trypanosoma cruzi. Analizar la capacidad de ambas de degradar ácidos nucleicos. Investigar su expresión en los diferentes estadíos del ciclo de vida y durante el creciemiento de epimastigotes en cultivo. Estudiar la localización subcelular y el rol biológico de una extensión N-terminal presente en TcNDPK2.   MATERIALES Y MÉTODOS: Para el estudio de la degradación de ácidos nucleicos las enzimas fueron incubadas en una mezcla de reacción conteniendo buffer Tris, Mg y diferentes sustratos de ADN. La expresión de las isoformas a lo largo del ciclo de vida y durante el crecimiento de epimastigotes fue abordada mediante la técnica de Western Blot. La localización subcelular fue estudiada mediante la técnica de inmunofluorescencia junto con diferentes tratamientos con detergentes y Western Blot. El rol biológico del dominio N-terminal denominado DM10 fue llevada a cabo mediante la construcción de parásitos transgénicos que sobrexpresan el dominio fusionado a la proteína reportera GFP.   RESULTADOS Y DISCUSIÓN: TcNDPK1, la isoforma canónica, fue detectada en los estadíos presentes en el hospedador vertebrado (tripomastigote y amastigote). Llamativamente, además de tener actividad fosfotransferasa fue capaz de degradar ácidos nucleicos in vitro. Esta actividad inespecífica es comparable al de las nucleasas clásicas, incluso las comerciales. Se observó degradación de diferentes templados de ADN, tanto plasmídicos como genómicos. TcNDPK2, que contiene un dominio denominado DM10 en el extremo N-terminal, fue detectada en los tres estadíos del ciclo de vida del parásito. En epimastigotes su expresión aumenta durante la fase exponencial de cultivo y localiza principalmente en el flagelo de los parásitos. Una fusión del dominio DM10 a GFP mostró que este dominio es suficiente para dirigir a GFP al flagelo sugiriendo que es al menos en parte la secuencia responsable de la localización flagelar de esta enzima. Por primera vez se reporta una NDPK de tripanosomátidos con actividad nucleasa (TcNDPK1). Esta actividad podría estar asociada a procesos de muerte celular programada. TcNDPK2 es la única NDPK flagelar (TcNDPK2) identificada hasta el momento. Además, es la primera función asociada al dominio DM10, presente en NDPKs de diferentes organismos, descubierta hasta el presente.