Secuenciación y ensamblado de loci ribosomales de tripanosomátidos

CAMARA MM; BOUVIER LA; SAYE M; DI GIROLAMO F; MIRANDA MR; PEREIRA CA

Buenos Aires

Encuentro; 4° Encuentro Internacional sobre Enfermedades Olvidadas y XVI Simposio sobre Control Epidemiológico de Enfermedades Transmitidas por Vectores; 2013

Fundación Mundo Sano

Introducción: El diagnóstico temprano de la enfermedad de Chagas es un factor importante para optimizar el tratamiento. En la actualidad, existen diversos métodos de diagnóstico los cuales deben poder discernir entre Trypanosoma cruzi y otros parásitos como ser Trypanosoma rangeli o Leishmania spp. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos métodos de diagnóstico que no presenten ambigüedades. A pesar que los polimorfismos del locus ribosomal son un blanco molecular utilizado para el diagnóstico, esta región no pudo ser ensamblada por el proyecto genoma de T. cruzi y hasta ahora solo se conocían secuencias parciales. Objetivos: Determinar polimorfismos dentro del locus ribosomal para el correcto diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Metodología: Cultivos de parásitos: Epimastigotes de Trypanosoma cruzi de la cepa CL Brener (salvajes o modificados genéticamente) se cultivan a 28ºC en medio LIT (triptosa de infusión de hígado) suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino y estreptomicina/penicilina. En el caso de los parásitos transgénicos se mantendrán las mismas condiciones con el agregado de 500ug/ml de geneticina. Clonado y secuenciación del locus ribosomal: A partir de secuencias parciales disponibles en las bases de datos, se generaron oligonucleótidos específicos para las distintas regiones del locus ribosomal. Luego los mismos fueron utilizados para realizar PCR, sobre muestras de ADN genómico, los productos fueron clonados y secuenciados. Las secuencias obtenidas fueron ensamblada con el programa BLAST y analizadas con el programa VECTOR NTI. Resultados y Conclusiones: En el presente trabajo, secuenciamos y ensamblamos completamente los loci ribosomales de, T. rangeli, Leishmania brasiliensis, de las la cepa Y y CL Brener de T. cruzi. Encontramos que el locus ribosomal presenta alrededor de 16 kb, presentando una estructura de tipo promotor ribosomal, 18S, 5,8S y 7 28S, 28Sα, 28Sβ, 28Sβ2, 28Sδ, 28Sε,28Sζ y 28Sθ en lugar de seis como en T. brucei. Por otra parte pudimos encontrar grandes diferencias entre los distintos organismos, en particular en las regiones transcribibles, no traducibles que podrían ser capitalizadas como herramientas de genotificación. Por otra parte, comenzamos a estudiar los sitios de procesamiento y complejos involucrados en los mismos que podrían ser utilizados como blancos terapéuticos al encontrarse diferencias con el hospedador mamífero.