PTRYPCHIP: UN PEQUEÑO VECTOR MODULAR PARA LA MANIPULACIÓN GENÉTICA DE TRIPANOSOMAS.

LEÓN ALBERTO BOUVIER, MARÍA DE LOS MILAGROS CÁMARA, MARIANA RENEE MIRANDA, CLAUDIO ALEJANDRO PEREIRA

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2011

sociedad argentina de protozoologia

Numerosas herramientas de manipulación genética utilizadas en la actualidad son el producto del refinamiento gradual de equivalentes obtenidas originalmente mediante técnicas anticuadas. En parte al indiscutido éxito de estas moléculas, algunas de sus limitaciones también resultaron preservadas. En la mayoría de los casos el intercambio de diferentes componentes es dificultoso o requiere numerosos pasos. A su vez, generalmente fueron diseñadas para unas pocas metodologías en organismos específicos. Por otro lado, frecuentemente los niveles de expresión obtenidos con algunas de estas herramientas, sobrepasan ampliamente los niveles fisiológicos. En este trabajo se desarrolló y construyó, a partir de constituyentes mínimos, un pequeño vector modular diseñado para la manipulación genética de tripanosomas. Existen diversas formas de intercambiar diferentes fragmentos. Estructuralmente se asemeja a pTEX (Kelly y col. 1992) sin embargo las secuencias intergénicas regulatorias se derivaron exclusivamente de Trypanosoma brucei y fueron seleccionadas específicamente por su reducida longitud, ausencia de sitios de enzimas de restricción y por corresponder a genes constitutivos. El gen de resistencia incorporado codifica la puromicina acetilasa (PAC) y fue modificado con el objetivo de eliminar secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción útiles en otras regiones de la construcción. A su vez expresa como una única proteína de fusión, los epítopes 3- FLAG, HA y alfa tubulina, la proteína verde fluorescente y los sitios de reconocimiento para las proteasas enteroquinasa (EK) y del virus jaspeado del tabaco (TEV). La construcción se propaga en Escherichia coli mediante un plásmido mínimo. En Trypanosoma cruzi este plásmido se comporta como un vector de expresión episomal otorgando resistencia a elevadas concentraciones de puromicina. Los niveles de expresión de la proteína de fusión, sin embargo, se encuentran claramente por debajo de los obtenidos para construcciones equivalentes basadas en pTEX. Por su parte en Trypanosoma brucei este vector posee la potencialidad para ser utilizado como construcción de expresión ectópica y alternativamente para el reemplazo de genes por variantes modificadas