Determinación de la estructura de la unidad oligosacarídica liberada del EPS de Rhizobium leguminosarum por la acción de una glicanasa bacteriana

LANDONI M; ZORREGUIETA A; TARSITANO J; COUTO AS; RODRIGUEZ MN

San Luis

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2022

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

Rhizobium leguminosarum sintetiza un polisacárido acídico que se secreta mayormente al medio extracellular conocido como exopolisacárido (EPS) y es retenido parcialmente en la superficie de la bacteria como polisacárido capsular (CPS). Ha sido demostrado que R. leguminosarum forma biofilms in vitro en medio mínimo y que la formación de dicho biofilm requiere la producción del EPS.1.2 El EPS consiste en un octasacárido ramificado repetitivo formado por glucosa, ac. glucurónico y galactosa en relación 5:2:1 y sustituido por ac. pirúvico, y acetato3. PlyB es una glicanasa de la familia Rap, proteínas extracelulares secretadas por el sistema de secreción tipo I PrsDE que se encuentran involucradas en la maduración del biofilm y con actividad de lectina por el CPS y el EPS. Se encuentra codificada en el cromosoma bacteriano y presenta actividad de glicanasa extracelular sobre carboximetilcelulosa (CMC) y el EPS cuando interactúa con un componente polisacarídico presente en la superficie de la bacteria.Con el fin de caracterizar la especificidad de PlyB, el EPS obtenido de la cepa salvaje luego de digestión con la enzima, fue analizado por cromatografía de exclusión molecular mostrando un aumento de una especie de bajo PM (LMW).4,5 La fracción LMW fue sometida a hidrólisis total y por HPAEC-PAD se determinó la presencia de glucosa y galactosa en relación 4.7/1 además de ac. glucurónico. Cuando dicha fracción se sometió a un análisis por E.M. ESI, fue interesante observar la presencia de un ion de m/z 1543.9962 (fig 1) que correspondería a la unidad repetitiva octasacarídica conteniendo una molécula de agua. Otra muestra de LMW fue sometida a metilación exhaustiva y analizada por nanoHPLC-ESI Orbitrap. Este análisis mostró a los 36.41 minutos de corrida, un ion de m/z 582.66 de carga +3 que al ser deconvolucionado corresponde a una unidad de PM 1744.98. Este valor junto al espectro MS/MS de dicho ion (fig.2) permitieron concluir que PlyB tiene actividad de 1-4 glucanasa