Sustratos y activadores de PchP de Pseudomonas aeruginosa

LISA, ANGELA TERESA; DOMENECH, CARLOS EDUARDO; OTERO, LISANDRO HORACIO

Editorial Académica Española

Lugar: Saarbrücken; Año: 2016 p. 122

978-3-8416-8218-5

Pseudomonas aeruginosa coloniza diferentes tejidos mediantevarios mecanismos. Uno de ellos, involucra la ruptura de los fosfolípidos de lamembrana de la célula huésped a través de la acción secuencial y coordinada delas enzimas fosfolipasa C hemolítica (PlcH) y fosforilcolina fosfatasa (PchP).La acción de PlcH sobre fosfatidilcolina o esfingomielina producefosforilcolina, la cual es hidrolizada a colina mas fosfato inorgánico por laacción catalítica de PchP. PchP es un miembro de la superfamilia de lashaloacido dehalogenasas (HAD) debido a la presencia de los tres motivoscaracterísticos conservados de esta superfamilia. En la enzima madura losmotivos I, II y III están constituidos por los residuos: 31DMDNT35,166S y 242K/261GDTPDSD267,respectivamente. Por lotanto, el objetivo de este trabajo fue caracterizar la participación dedichos residuos en la interacción con el fosfato y el metal, y establecer elfuncionamiento catalítico de esta enzima en diferentes condicionesfisiológicas.Estudiosde mutación sitio-dirigida y análisis cinéticos demostraron que en la interacción con el fosfato del sustrato participanlos residuos D31, D33y S166 a través de cuatro diferentes átomos de oxígeno (O1,O2, O3 y O4). En donde O1-P(O)3y O4-P(O)3 están unidos a los grupos carboxílicos (Od2)D31 y (Od1)D33, respectivamente. Por otro lado, O2-P(O)3 interaccionacon un átomo de nitrógeno de D33 y con un grupo hidroxilo de S166,mientras que O3-P(O)3 lo hace con un átomo de nitrógenode S166. En cuanto a la interacción con el metal están involucrados seisligandos conformando un complejo octaédrico. La coordinación ocurre con un parde electrones aportados por los átomos de oxígeno de los COO- de (Od1)D31 y (Od2)D262 y del C=O (Oa) de D33 y con un oxígenodel fosfato (O1-P) que luego forma el complejo monodentado M-O1-P-(O)3.Las otras dos valencias secundarias del Mg2+ son ocupadas con dosmoléculas de H2O una de las cuales es estabilizada por el residuo D267.Estudioscinéticos realizados con Mg2+ o Zn2+ a pH 5,0 reflejaronun mecanismo de activación  ordenado en presencia de p-NPP como sustrato y al azar con fosforilcolina. En donde Zn2+ demostró en ambos casos unamayor eficiencia catalítica, lo cual fue interpretado mediante el principio dePearson, en donde este metal actuando como ácido de Lewis encontraría unadureza similar a la proporcionada por los diferentes ligandos de la esfera decoordinación. En presencia de compuestos de amonio cuaternario se observó unmecanismo de inhibición tipo mixto: competitivo-acompetitivo parcial, lo cualpermitió establecer la presencia de dos sitios de interacción con el amoniocuaternario: uno catalítico relacionado al fosfoester y otro regulatorioresponsable de la unión de los compuestos N-trimetil. En donde, los residuos E42,E43 y 82YYY84 podrían estar participandodirecta o indirectamente. A su vez, Zn2+ demostró un mayor papelprotector frente a la inhibición provocada por fosforilcolina o compuestos deamonio cuaternario sobre el sitio regulatorio, posiblemente debido a un cambioconformacional en el centro del sitio activo.Con fosforilcolina como sustrato, se observó que Mg2+ esactivador a pH 5,0 o 7,4 con la misma eficiencia. Sin embargo, Zn2+es activador a pH 5,0 pero inhibidor a pH 7,4. Esta inhibición es reversible yocurre en presencia o ausencia de Mg2+. Considerando cálculosfísico-químicos se estableció que dicha inhibición es desencadenada por la hidrólisisdel complejo [Zn2+L2-1L20(H2O)2],la cual provoca un cambio en la geometría de coordinación del metal deoctaédrica a tetraédrica.Por otrolado, se establecieron las condiciones de cristalización y se obtuvieron losdatos preliminares de difracción los cuales arrojaron un grupo espacialmonoclínico C2 con dimensiones de laceldilla de a = 137,16 Å, b = 159,15 Å, c = 73,31 Å, β=117,89°.