Producción y caracterización de la proteína de cápside del virus del Zika

BYK, LA; MARSICO, FL; COSTA NAVARRO, GS; GAMARNIK, AV

La Habana

Otro; 15vo Curso Internacional de Dengue y Zika; 2017

Instituto Pedro Kouri

El virus de Zika (ZIKV) perteneciente al género Flavivirus, es un patógeno emergente relacionado con otros virus causantes de enfermedades humanas como el virus del dengue, el de la fiebre amarilla, y otros virus de gran relevancia a nivel mundial. Este grupo de virus se caracteriza por estar constituido por un genoma de ARN simple cadena de polaridad positiva que actúa como ARN mensajero para la síntesis de una poliproteína. Una vez replicado el genoma viral, éste interacciona con la proteína de cápside para la morfogénesis de nuevas partículas virales. La proteína de cápside de los flavivirus es la proteína viral menos conservada, que presenta identidades de secuencia menores al 40%. Sin embargo, en todos los casos conserva sus propiedades estructurales y la distribución aminoacídica necesaria para su función esencial en la propagación de la infección. La importancia del estudio de las proteínas de cápside virales reside en la posibilidad de utilizarlos como posibles blancos para el desarrollo de estrategas antivirales. Dada la necesidad de generar herramientas moleculares para el estudio y caracterización de la proteína de cápside del virus del Zika, el objetivo del presente trabajo fue clonar, expresar y purificar la proteína completa de aislamientos epidémicos y no epidémicos para su utilización en ensayos bioquímicos y funcionales. Para ello, se clonó el marco abierto de lectura de la proteína amplificado a partir de ARN de infecciones con el aislamiento KX198134 del virus (Senegal) en un vector de expresión bacteriano (pQE-30). Luego, se realizó la puesta a punto de la expresión de la proteína en bacterias E. coli BL21 hasta obtener un nivel adecuado para su posterior purificación. Debido a la alta densidad de cargas positivas, es posible purificarla por cromatografía de afinidad a partir de lisados bacterianos sin necesidad de la presencia de un tag de purificación. En este caso, se llevó a cabo la purificación por medio de columnas de heparina y elución empleando concentraciones salinas crecientes. Posteriormente, las fracciones recolectadas que contenían la proteína fueron sembradas en columnas de exclusión molecular, que permitieron la obtención de la proteína con altos niveles de pureza. Una vez obtenida la proteína pura, se realizaron estudios bioquímicos de dispersión de luz y unión a ácidos nucleicos. Se determinó por static light scattering que la proteína de cápside en solución se encuentra como un dímero de 31kDa. Adicionalmente, la proteína de cápside fue utilizada para la producción de anticuerpos policlonales en ratón y su posterior aplicación en ensayos de western blot e inmunofluorescencia sobre células de mamífero infectadas con el virus, donde fue detectada desde las 15 hpi. El desarrollo de esta nueva herramienta, permitirá llevar a cabo nuevos estudios que aporten información sobre la función de la proteína de cápside del virus de Zika y para el desarrollo de enfoques novedosos para posibles estrategias antivirales.