Aplicación de RMN al estudio estructural de U-Omp19, un inhibidor de proteasas bacteriano con actividad adyuvante.

RASIA, R; CASSATARO, J.; CERUTTI, M.L.; PASQUEVICH, K.A.; DARRIBA, M.L; KLINKE, S.

Ciudad de Buenos Aires

Taller; IV Taller de Resonancia Magnética; 2018

Fund. Instituto Leloir

Omp19 es una lipoproteína presente en la membrana de Brucella abortus. En nuestro laboratoriohemos demostrado que U-Omp19 (la fracción proteica de Omp19) es un inhibidor de proteasascon actividad adyuvante, siendo capaz de inhibir las principales proteasas presentes en tractogastrointestinal, así como diversas proteasas lisosomales. Esta propiedad podría serfundamental tanto para su adyuvanticidad (aumentando la vida media de los antígenos coadministrados)así como también para la virulencia de B. abortus (protegiendo a la bacteriadurante el establecimiento de la infección oral).Con el fin de comprender el mecanismo molecular y las regiones de la molécula fundamentalespara su actividad, comenzamos a estudiar la estructura de U-Omp19.El análisis in sílico de la secuencia predijo que U-Omp19 pertenece a la familia I38, una familiade inhibidores de proteasas bacterianos que se caracterizan por poseer una estructura terciariade tipo barril β. En base a la homología de secuencia, se predijo que la actividad inhibitoria podríaestar comprendida entre los residuos 61-158, que formarían el dominio compacto, mientras quela primera porción de la proteína sería desordenada, sin estructura secundaria definida.Los estudios de SLS y DLS indicaron que U-Omp19 se comporta como un monómero de 16.8kDa. La evaluación inicial de la estructura terciaria a través de RMN demostró que U-Omp19 esestable en solución, presentando una conformación plegada y homogénea, sin agregadosapreciables, por lo que fue factible realizar estudios avanzados de RMN sobre la proteína.La asignación de la proteína doblemente marcada (15N, 13C) confirmó que U-Omp19 posee unaregión flexible entre los aminoácidos 1-64 y un dominio C-terminal compacto con estructurasecundaria principalmente de tipo β entre los residuos 70-158.El cálculo de las estructuras de menor energía obtenidas a partir de los desplazamientosquímicos de la cadena principal (entre los residuos 61-158), utilizando el programa Rosetta,confirmó que U-Omp19 presenta un plegamiento similar a los otros miembros de la familia I38,con una estructura terciaria de tipo barril β compacto.Esta estructura fue confirmada con posterioridad por estudios de cristalografía y difracción deRayos-X, sobre una versión recombinante basada sólo en el dominio globular. Estos datospermitieron demostrar que el barril está formado por 8 láminas β-antiparalelas definiendo unnúcleo muy compacto altamente hidrofóbico, con un polo rígido y bien definido, y el otro conbucles largos y flexibles. Sin embargo, esta nueva construcción no conserva la capacidad deinhibir proteasas que posee U-Omp19, lo que sugiere que esta actividad puede residir en eldominio flexible N-terminal, o que son necesarios ambos dominios de la proteína.Es por ello, que como perspectiva de este trabajo, se estudiará a través de RMN la región flexiblede la molécula, así como también trabajaremos con diversas variantes truncadas de U-Omp19,(que conservan el dominio compacto, y porciones cada vez más extensas del dominio N-terminal)para intentar dilucidar el mecanismo de inhibición.