MECANISMO DE RECONOCIMIENTO DE ARN POR UN ANTITERMINADOR TRANSCRIPCIONAL VIRAL

CHEMES LUCIA; DE PRAT GAY GONZALO; IVANA MOLINA; SEBASTIAN ESPERANTE

Salguero

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

La infección por el Virus Respiratorio Sincicial Humano es la principal causa de enfermedad severa del tracto respiratorio inferior en niños e infantes. A pesar del conocimiento acumulado acerca del virus, no se cuenta con una vacuna ni antivirales eficientes. El complejo polimerasa es clave para su ciclo biológico, se encarga de la replicación del genoma, la transcripción y las modificaciones post-transcripcionales. Comprende ARN unido a la nucleocápside N y las proteínas P, L, y M2-1.La proteína M2-1 es un tetrámero de 194 aminoácidos; tiene función de antiterminador de la transcripción, y de factor elongador aumentando la procesividad de la polimerasa, para lo cual necesita unirse al ARN. Se sabe que M2-1 reconoce ARNs de distinta naturaleza a través de su región ?core? (69-172 aminoácidos) pero se desconoce su especificidad. La proteína P también interactúa con M2-1 a través de la región ?core? con alta afinidad para reclutarla al complejo polimerasa.Estudios espectroscópicos en solución revelaron que la afinidad del tetrámero M2-1 por ARN aumenta a mayor longitud de este último. La unión ARN-proteína es de alta afinidad (KD~25 nM) y es cooperativa con una estequiometría de unión 2:1 (dos moléculas de ARN por tetrámero) para ARNs de 15 y 20 nucleótidos.La cinética de asociación M2-1 con ARN reveló una fase lenta, que llega al equilibrio a los 5 minutos.Ensayos de competencia con la proteína P revelaron un desplazamiento efectivo del ácido nucléico del complejo M2-1-ARN, sugiriendo superposición de los sitios de contacto.Por último, utilizando una versión monomérica de M2-1 correspondiente a la región "Core" observamos unión a ARN con menor afinidad (KD~1.3 uM) y desplazamiento por la proteína P aunque la afinidad de M2-1 core por P (KD~250 nM) es menor que la de M2-1 completa (KD~8 nM), sugiriendo que la tetramerización y posiblemente sitios adicionales al ?core" contribuyen significativamente a la asociación con ARN y con el cofactor P.