La proteína NS5 del virus del dengue 2 altera el splicing celular durante la infección

DE MAIO, F.A.; RISSO, G.; IGLESIAS, N.G.; SHAH, P.; KROGAN N; ANDINO R; SREBROW A; GAMARNIK, A.V.

CABA

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología; 2015

Asociación Argentina de Microbiología

El virus del dengue pertenece, al igual que otros virus de importanciapara la salud humana, a la familia Flaviviridae. Posee ungenoma de ARN simple cadena de polaridad positiva de unas 11 Kb el cualcontiene un único marco abierto de lectura. El ARN viral es traducido en unapoliproteína precursora de 10 proteínas virales. La proteína NS5 es la de mayortamaño (105 kDa), con un dominio metiltransferasa y otro ARN polimerasadependiente de ARN, siendo fundamental para la replicación viral. Con elobjetivo de identificar proteínas celulares que interaccionan con NS5 durantela infección, se abordó un proyecto de proteómica. Para esto se desarrolló un virus recombinanteque expresa NS5 fusionada a un péptido de purificación Strep-tag. Esto permite la recuperación de la proteína viral formando parte de complejos proteicosnativos en el contexto de una infección. Utilizando como herramienta este virusmodificado, se infectaron líneas celulares humanas y se procedió luego aanalizar por espectrometría de masa las proteínas recuperadas. Se identificaronasí más de 50 proteínas celularescon interacción específica a NS5 durante la infección. Entre estas se observóla presencia de componentes del spliceosoma, destacándose entre ellos variosfactores que integran la ribonucleoproteína denominada complejo U5. Estoshallazgos fueron validados por estudios de interacción de NS5 sobre-expresadacon componentes específicos del spliceosoma por medio de co-precipitaciones.Con el fin de indagar sobre un posible efecto de la infección viralsobre el splicing celular,  analizamos encélulas no infectadas e infectadas una serie de eventos de splicing alternativode distintos genes por una estrategia de PCR que permite detectar las distintasformas resultantes de este proceso (inclusión o exclusión de un determinadoexón en el ARN mensajero maduro). Mediante esta técnica determinamos que lainfección viral tiene un claro efecto sobre la abundancia relativa de las isoformasanalizadas.  En vista de estos hallazgos,estudiamos el efecto directo de la proteína NS5 sobre eventos de splicing pormedio de la sobre-expresión de la proteína fuera del contexto de la infección. Paraello transfectamos un vector de expresión de NS5 conjuntamente con plásmidosportando ?minigenes?, construcciones utilizadas como reporteras de splicing.Los resultados de estos ensayos mostraron un importante efecto de NS5 alterandola relación de isoformas en el sistema usado. Por último, para estudiar la relevancia quela interacción NS5-spliceosoma pudiera tener para la replicación viral,decidimos realizar ensayos de interferencia para componentes del spliceosoma identificadoscomo interactores de NS5. Interesantemente, se observó que al interferirciertos factores del complejo U5 se produjo un incremento significativo en la  replicación viral.Los resultados obtenidos indican que el virus del dengue altera elpatrón de splicing en células humanas infectadas por un mecanismo que involucraa la proteína NS5 y que probablemente esto de lugar a un estado celular másfavorable para la replicación viral.