Obtención de anticuerpos de llama contra antígeno de melanoma humano metastásico

LACREU, MARÍA LAURA; URRUTIA MARIELA

Buenos Aires

Jornada; XXX Jornadas de Oncología. Instituto Angel H. Roffo. ?Viejos y nuevos paradigmas de la Oncología. Prevención y nuevos blancos moleculares; 2015

Instituto Angel H. Roffo

OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS DE LLAMA (VHH) CONTRA ANTÍGENO DE MELANOMA HUMANO METASTÁSICO.Seleccionamos por display en fago, 4 fagos-VHH reactivos contra células de melanoma humano metastático (MHM) mediante Dry cell ELISA y citometría de flujo. Una vez realizada la selección, se trabajó con la forma soluble del VHH independizándonos del fago.El binding de los VHHs solubles frente a 2 líneas celulares de MHM y a 2 líneas celulares de fibroblastos, se evaluó mediante citometría de flujo. Los 4 VHHs reconocen con gran intensidad a las células de MHM evaluadas. Los VHHs 44, 54 y 58 también reconocen a los fibroblastos. En tanto que el VHH50 es el único que sólo reconoce células de MHM. Dado que esta especificidad podría estar indicando que es un antígeno (Ag) específico de melanoma, se eligió el VHH50 como candidato para identificar su Ag.El extracto de proteínas de membrana de XY3 se analizó por SDS-PAGE y WB, revelándose con VHH50 - anti myc - anti ratón HRP. Se observó una banda característica de glicoproteínas de ~140 kDa, ausente al revelar con VHH inespecífico. Debido a evidencias de que podría tratarse de un Ag glicosilado, se trató el extracto de membranas con la glicosidasa PNGasa F y se analizó por WB obteniéndose 2 bandas específicas de ~80 kDa y ~60 kDa, a diferencia de la banda única de ~140 kDa obtenida al correr el extracto sin tratar. Las 3 bandas se cortaron de un SDS-PAGE y se analizaron por espectrometría de masa (EM). Dado que las bandas estaban compuestas de una mezcla de proteínas, se necesitó realizar una inmunoprecipitación (IP) para limpiar el sistema.Extractos de membranas de XY3 incubadas con el VHH50 se fijaron con paraformaldehido (PFA) 1.5%. Se extrajeron las proteínas de membrana y se realizó una IP con Ac anti myc y proteína G-sepharosa. Al crackear las muestras para sembrar un SDS-PAGE se revirtió la fijación con PFA por calor. Mediante análisis de un WB revelado con VHH50- anti myc- anti ratón HRP se identificaron 2 posibles bandas correspondientes al Ag ausentes en la IP realizada con un VHH inespecífico. A partir de un SDS-PAGE se cortaron dichas bandas candidatas y se sometieron a la técnica de EM. Se discutirá el resultado del análisis de la EM.