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Las proteínas que forman estructuras poliméricas inducen una alta respuesta inmune en hospedadores inmonucompetentes. Algunas de estas partículas también poseen la capacidad de actuar como carriers de polipéptidos pequeños, que unidos a la estructura de estas proteínas se convierten en inmunógenos poderosos. La enzima lumazina sintetasa de Brucella spp (BLS) presenta una estructura cuaternaria decamérica, de gran resistencia. El análisis estructural de BLS mostró que es posible insertar péptidos en sus 10 extremos amino terminales, dando como resultado proteínas quiméricas con un alto nivel de repetitividad y organización, que inducen eficientes respuestas inmunes. Hasta el momento, unidos a BLS, se han logrado expresar con éxito KETc1, un péptido que induce protección frente a la cisticercosis porcina y RBD3, un dominio de unión a ARN. El desafío consiste en lograr proteínas de fusión estables cuando se insertan dominios proteicos de un mayor tamaño. Creemos que la proteína VP8, del rotavirus bovino (RVB) es una buena candidata para ser fusionada con BLS, por sus propiedades fisico-químicas e inmunológicas. La VP8 ha sido expresada en diferentes sistemas: bacterias, baculovirus, levaduras y plantas de tabaco y en todos los sistemas las proteínas recombinantes han inducido la producción de anticuerpos neutralizantes. El RVB se encuentra ampliamente distribuído en nuestro país ocasionando diarreas aproximadamente en el 80% de los rodeos argentinos. Son virus desnudos, formados por una triple cápside proteica y 11 segmentos de ARN doble cadena. La cápside externa del RVB esta formada por VP7 y VP4. Durante la infección, VP4 es clivada por enzimas proteolíticas presentes en el tracto gastrointestinal, de modo que se generan dos proteínas estructurales VP5 (60 kDa) y VP8 (28 kDa). Se ha demostrado que este proceso aumenta la infectividad viral, resultando clave en la protección frente a la infección por RVB la inmunidad de mucosas. El presente proyecto propone evaluar la capacidad de la quimera BLS-VP8 para inducir una eficiente respuesta inmune apoyado en excelentes resultados obtenidos con la utilización de BLS como presentador de antígenos. El gen de BLS ha sido obtenido a partir del genoma de Brucella spp. mediante PCR con los primers correspondientes y clonado en el vector de expresión procariota pET 11a. El gen de VP8 se obtuvo por RT-PCR a partir de sobrenadante de células MA 104 infectadas con RVB C486 (G6P[1]), fue clonado en el vector pGem-T Easy y subclonado río arriba de BLS en el vector pET 11a-BLS. De esta manera se generaron 3 vectores de expresión procariota: pET 11a-BLS, pET 11a-VP8-BLS y pET 11a-VP8, por eliminación con enzimas de restricción de la secuencia codificante de BLS. La expresión proteica se indujo con IPTG. Las proteínas recombinantes BLS-VP8, BLS y VP8 se han purificado mediante columnas cromatográficas de intercambio iónico y exclusión molecular, y han sido caracterizadas fisico-quimicamente mediante técnicas de Dicroísmo Circular y Light Scatering. Sus propiedades antigénicas fueron evaluadas por Western Blot, mostrando reactividad frente a un suero policlonal de conejo anti VP8 y frente a un suero policlonal de ratón anti BLS. La capacidad inmunogenica de la quimera fue evaluada en el modelo murino. La respuesta especifica de anticuerpos se determino por ELISA. Conclusiones: · Se lograron expresar, purificar y caracterizar las diferentes proteínas recombinantes BLS-VP8, BLS y VP8. · Se confirmó el correcto plegamiento y la estabilidad termodinámica de las proteínas purificadas. · Tanto BLS como VP8 mantuvieron sus propiedades estructurales características formando parte de la proteína quimera BLS-VP8. · Estos resultados sugieren que es posible insertar dominios proteicos o proteínas pequeñas en el extremo amino de BLS sin afectar su plegamiento general ni sus características antigénicas.