IIBBA   05544
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOQUIMICAS DE BUENOS AIRES
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
La proteína NS3 del virus del dengue modula la interacción de los extremos del ARN viral in vitro
Autor/es:
LEOPOLDO G. GEBHARD; SERGIO B. KAUFMAN; ANDREA V. GAMARNIK
Lugar:
Ciudad de Buenos Aires
Reunión:
Congreso; X Congreso Argentino de Virología; 2011
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Virología-Asociación Argentina de Microbiología
Resumen:
El virus
del dengue pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. Los
flavivirus son virus envueltos que contiene un genoma con una sola hebra de ARN
de sentido positivo. El genoma es de aproximadamente 11.000 nucleótidos de
longitud, con un extremo 5ʹ capeado, y un extremo 3ʹ que carece de cola poliadenilada. Este genoma contiene un marco abierto
de lectura único que codifica para una poliproteína precursora de ~3400
aminoácidos. Esta poliproteína da origen a tres proteínas estructurales (C, prM y E) y siete proteínas no
estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3; NS4A, NS4B y NS5). La mayoría de estas
proteínas no estructurales participan en la formación de complejos de
replicación del ARN viral asociados a estructuras membranosas. A su vez, este marco
abierto de lectura está flanqueado por las regiones 5ʹ y 3ʹ no codificantes que
poseen varios elementos estructurales y secuenciales muy conservados
involucrados en la regulación de la replicación viral. Los extremos 5ʹ y 3ʹ del genoma viral
contienen segmentos de
secuencias complementarias necesarias para establecer interacciones de largo
alcance y, de este modo, acercar el promotor de la polimerasa viral presente en
el extremo 5ʹ del genoma viral con el sitio de iniciación de la síntesis de ARN en el
extremo 3ʹ del genoma viral. Se ha
demostrado que el genoma del virus del dengue se encuentra tanto en la
conformación lineal como circular, y que el balance entre estas conformaciones
es esencial para la replicación del virus.
NS3 presenta varias actividades enzimáticas. El
extremo N está formado por un domino con actividad de proteasa, mientras que la
región del extremo C comprende un dominio de helicasa/ATPasa. Se especula que
la actividad helicasa promueve cambios conformacionales en las regiones estructuradas
del genoma viral necesarios para el ensamblaje de los complejos de replicación,
el eficiente procesamiento del ARN genómico naciente, entre otros procesos. En
este trabajo estudiamos el rol de la proteína viral NS3 en la remodelación de
estructuras secundarias de moléculas de ARN. Para ello, clonamos, expresamos y
purificamos la proteína recombinante NS3 del virus del dengue serotipo 2.
Desarrollamos ensayos in vitro para la cuantificación de las actividades
enzimáticas en condiciones controladas. Empleando un dúplex de ARN pequeño
demostramos que la helicasa NS3 del virus del dengue establece un estado
estacionario dependiente de ATP entre el desdoblamiento y la rehibridización de
dúplex de ARN, lo que permite regular el balance entre las dos configuraciones
del ARN (doble cadena versus simple cadena) por medio de la concentración de
ATP. Por otra parte, desarrollamos un ensayo de cambio de movilidad
electroforética en geles nativos de poliacrilamida para medir la interacción
entre moléculas de ARN complejas con regiones complementarias como son los
extremos del genoma viral. Con este método demostramos que NS3 es capaz de
modular in vitro la formación del complejo entre los extremos 5ʹ y 3ʹ del ARN genómico viral en respuesta a la
disponibilidad de ATP.