La proteína NS3 del virus del dengue modula la interacción de los extremos del ARN viral in vitro

LEOPOLDO G. GEBHARD; ANDREA V. GAMARNIK

Ciudad de Buenos Aires

Encuentro; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2011

Sociedad Argentina de Virología-Asociación Argentina de Microbiología

El virus del dengue pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. Los flavivirus son virus envueltos que contiene un genoma con una sola hebra de ARN de sentido positivo. El genoma es de aproximadamente 11.000 nucleótidos de longitud, con un extremo 5ʹ capeado, y un extremo 3ʹ que carece de cola poliadenilada. Este genoma contiene un marco abierto de lectura único que codifica para una poliproteína precursora de ~3400 aminoácidos. Esta poliproteína da origen a tres proteínas estructurales (C, prM y E) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3; NS4A, NS4B y NS5). La mayoría de estas proteínas no estructurales participan en la formación de complejos de replicación del ARN viral asociados a estructuras membranosas. A su vez, este marco abierto de lectura está flanqueado por las regiones 5ʹ y 3ʹ no codificantes que poseen varios elementos estructurales y secuenciales muy conservados involucrados en la regulación de la replicación viral. Los extremos 5ʹ y 3ʹ del genoma viral contienen segmentos de secuencias complementarias necesarias para establecer interacciones de largo alcance y, de este modo, acercar el promotor de la polimerasa viral presente en el extremo 5ʹ del genoma viral con el sitio de iniciación de la síntesis de ARN en el extremo 3ʹ del genoma viral. Se ha demostrado que el genoma del virus del dengue se encuentra tanto en la conformación lineal como circular, y que el balance entre estas conformaciones es esencial para la replicación del virus. NS3 presenta varias actividades enzimáticas. El extremo N está formado por un domino con actividad de proteasa, mientras que la región del extremo C comprende un dominio de helicasa/ATPasa. Se especula que la actividad helicasa promueve cambios conformacionales en las regiones estructuradas del genoma viral necesarios para el ensamblaje de los complejos de replicación, el eficiente procesamiento del ARN genómico naciente, entre otros procesos. En este trabajo estudiamos el rol de la proteína viral NS3 en la remodelación de estructuras secundarias de moléculas de ARN. Para ello, clonamos, expresamos y purificamos la proteína recombinante NS3 del virus del dengue serotipo 2. Desarrollamos ensayos in vitro para la cuantificación de las actividades enzimáticas en condiciones controladas. Empleando un dúplex de ARN pequeño demostramos que la helicasa NS3 del virus del dengue establece un estado estacionario dependiente de ATP entre el desdoblamiento y la rehibridización de dúplex de ARN, lo que permite regular el balance entre las dos configuraciones del ARN (doble cadena versus simple cadena) por medio de la concentración de ATP. Por otra parte, desarrollamos un ensayo de cambio de movilidad electroforética en geles nativos de poliacrilamida para medir la interacción entre moléculas de ARN complejas con regiones complementarias como son los extremos del genoma viral. Con este método demostramos que NS3 es capaz de modular in vitro la formación del complejo entre los extremos 5ʹ y 3ʹ del ARN genómico viral en respuesta a la disponibilidad de ATP.