VÍAS DE MUERTE CELULAR INDUCIDA POR TERAPIA FOTODINÁMICA EN CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA DE PULMÓN

TEIJO MJ,; DIEZ B,; CASSINELLI, J; BATLLE A,; FUKUDA H

CABA

Congreso; 14º CONGRESO MEDICINA INTERNA HOSPITAL de CLINICAS José de San Martin; 2012

HOSPITAL de CLINICAS José de San Martin

La Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento terapéutico clínicamente aprobado para tumores superficiales y obstructivos, mínimamente invasivo, que ejerce una citotoxicicdad selectiva hacia células malignas. Implica la administración de un agente fotosensibilizante seguido de irradiación con luz de longitud de onda correspondiente a la banda de absorción de dicho sensibilizante. En presencia de oxígeno, una serie de reacciones fotoquímicas llevan a la muerte de las células tumorales. El ácido 5-aminolevúlico (ALA), es el precursor biológico de la síntesis de porfirinas, acumulando especialmente protoporfirina IX (PpIX), un fotosensibilizante endógeno. En la erradicación de tumores mediante TFD  intervienen diferentes procesos de muerte celular, que pueden coexistir. El objetivo del presente trabajo fue determinar la participación de las distintas vías de muerte celular luego de aplicar TFD basada en ALA. La TFD se llevó a cabo incubando células A549 (adenocarcinoma de pulmón, humanas) con ALA 1mM durante 3hs, seguido por una irradiación en un banco de tubos fluorescentes. Al cabo de 1h se realizaron los ensayos de muerte celular: estudios morfológicos de microscopía convencional, de fluorescencia y electrónica. Citometría de flujo y western blot. Previamente, se determinó una localización mitocondrial para la PpIX. Asimismo, al irradiar las células en presencia de sondas fluorescentes para mitocondrias y lisosomas se pudo observar liberación de la sonda al citoplasma y disrupción de las organelas analizadas. En base a esto se sugiere que el daño mitocondrial y lisosomal es un indicador de la posible participación de la vía apoptótica intrínseca. Los análisis morfológicos y bioquímicos confirmaron características apoptóticas 1h post-TFD tales como encogimiento celular, cuerpos apoptóticos en la membrana y condensación de la cromatina, así como marcación positiva de AnnexinV-FITC/ioduro de propidio para células apoptóticas (TFD 20 min: 26,8±4,1%) de manera dosis lumínica dependiente. En las dosis de TFD más altas (20 min) la población de células necróticas aumenta levemente (TFD 20 min: 8,7±1,9%). A fin de estudiar la participación lisosomal en la inducción de apoptosis las células fueron incubadas con el inhibidor de catepsina D, pepstatina A (100mm), irradiadas por 10 min y marcadas con AnnexinV-FITC/ioduro de propidio. El inhibidor no logró reducir significativamente la apoptosis (TFD 10 min: 17,3±4,2%; TFD 10 + Pepstatina A: 21,9±5,1%), lo cual sugiere que el daño a lisosomas es un efecto secundario y no un iniciador en la muerte celular por TFD. La reducción de la expresión de procaspasa-3, la liberación dosis-lumínica dependiente de citocromo c y la despolarización de la membrana mitocondrial post-TFD 10 min (DIOC6: 23,8±1,3% y Rhodamina 123: 32,1±11,1%) apoyan la hipótesis de la vía apoptótica intrínseca. Sin embargo, en imágenes de microscopía electrónica, puede observarse una marcada desorganización celular y la presencia de vacuolas de doble membrana, lo cual sugiere una vía de autofagia, consistente con el daño a las organelas. Si bien la vía apoptótica intrínseca parece ser la predominante en la muerte celular por TFD, debe tenerse en cuenta la participación de otros procesos como necrosis o autofagia.