El estudio del interactoma de la Nucleoproteína de arenavirus revela nuevos factores celulares que intervienen en el crecimiento viral

DALLARI S; FERNANDES L; ZUNIGA EI; LOUREIRO ME; FOSCALDI S; LOPEZ N; MAROOKI N; RADOSHITZKY S

C.A.B.A.

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

SAV-AAM

El género Mammarenavirus (arenavirus que infectan mamíferos) se divide en dos grandes grupos, virus del Viejo y del Nuevo Mundo, que incluyen virus patógenos productores de fiebres hemorrágicas en humanos, tales como el virus de Fiebre del Lassa (LASV), endémico en África, y el virus Junín (JUNV), agente causal de la Fiebre Hemorrágica Argentina, entre otros. El virus de la Coriomeningitis Linfocitaria (LCMV), de distribución mundial, es considerado prototipo de los arenavirus del Viejo Mundo y ha sido ampliamente utilizado como modelo experimental dada su alta homología génica y antigénica con LASV. Hasta el momento, se dispone únicamente de una vacuna (para JUNV) y los recursos terapéuticos son limitados. La nucleoproteína (NP) de arenavirus es la proteína viral más abundante y juega un rol fundamental en la replicación, transcripción, ensamblado y morfogénesis viral. Poco se conoce acerca de los factores del huésped que participan como facilitadores y/o reguladores de estos procesos. Con la finalidad de encontrar blancos celulares de relevancia para el crecimiento viral, se llevó a cabo un análisis proteómico a gran escala en células de epitelio pulmonar (A549), identificándose una serie de proteínas celulares que unen NP de LCMV y LASV. Dichas interacciones proteína-proteína fueron confirmadas para varios de los candidatos mediante ensayos de coinmunoprecipitación, tanto en un sistema de expresión de NP recombinante, como en el contexto de una infección con LCMV. A su vez, estas interacciones fueron confirmadas para la NP de varios arenavirus del Nuevo Mundo, incluyendo JUNV. Posteriormente, se evaluó la producción viral de LCMV tras el silenciamiento de algunos de los candidatos por la técnica ARN de interferencia (siRNA, small interfering RNA). Los títulos virales en sobrenadantes de cultivo a las 24, 48 y 72 h.p.i. fueron analizados por ensayos de formación de placas y los niveles de ARN viral presentes en lisados celulares a las 24h.p.i., por RT-PCR. Aquellos candidatos cuyo silenciamiento indujo una reducción significativa en el crecimiento viral, fueron luego seleccionados para la generación de líneas celulares con ablación estable del gen de interés mediante la técnica de edición génica CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interespaced Short Palindromic Repeats). Consistentemente, se observó una reducción significativa en los valores de ARN y producción viral de LCMV, así como en de LASV y JUNV, en células genéticamente modificadas. Mediante este estudio se identificaron nuevos blancos celulares implicados en interacciones virus-huésped de relevancia para la familia Arenaviridae. El avance en el conocimiento de factores que interactúan en forma directa con NP permitirá comprender cuales son los requerimientos críticos para que NP cumpla adecuadamente sus funciones, así como fundar bases para el desarrollo racional de compuestos antivirales.