Regulación de la replicación del arenavirus Tacaribe por la proteína kinasa C (PKC)

LÓPEZ NORA; FOSCALDI SA; DANTUONO A; DANTUONO A; REY O; REY O; LÓPEZ NORA; FOSCALDI SA

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

La actividad de kinasas celulares ha sido implicada en la multiplicación de virus pertenecientes a diversas familias, incluyendo Arenaviridae. El virus Tacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo, es un modelo ampliamente utilizado para estudiar los mecanismos moleculares que median la replicación de esta familia de virus. Por lo tanto, examinamos el efecto de un panel de inhibidores específicos para las proteína-kinasas PKCs, PKDs, PKA y AKT sobre la replicación viral empleando un sistema minireplicón. Este se basa en la coexpresión de un minigenoma (análogo al segmento genómico S de TCRV) que codifica para el gen reportero Luciferasa de Firefly (LUC), junto con las dos proteínas virales requeridas para sostener la transcripción y replicación del genoma viral, la Nucleoproteína (NP) y la polimerasa (L). Células BSR fueron preincubadas con los inhibidores y luego transfectadas con los plásmidos que expresan los componentes del sistema, además de un plásmido control que expresa Luciferasa de Renilla (REN). Luego de una incubación por 24 hs en presencia de los inhibidores, se procedió a la determinación de la actividad de LUC y REN en los lisados celulares. Los resultados revelaron que la incubación con el inhibidor Go6983 (2,5 µM final), que inhibe un amplio espectro de PKCs, como con GF109203X (3,5 µM) o Go6976 (1µM), que inhiben selectivamente las isoformas α y β de PKC, causó un aumento de 60 a 90% en la replicación del minigenoma respecto al control. El efecto no fue observado cuando se utilizaron inhibidores de PKD, Akt o PKA. A fin de obtener evidencia adicional, células Vero fueron preincubadas durante 3 horas con cada uno de los inhibidores de PKC (GF109203X, Go6983 o Go6976), y luego infectadas con TCRV a una multiplicidad de infección de 0,1-3 PFU/ml. Luego de una incubación por 48 hs en presencia de los inhibidores, el virus liberado a los sobrenadantes celulares fue cuantificado mediante titulación en un ensayo de placas, y el nivel intracelular de ARN viral fue determinado mediante RT-qPCR. Además, la presencia de NP en los lisados de células tratadas en paralelo fue analizada mediante Western Blot. Los resultados indicaron que la incubación de las células con los inhibidores de PKC causó un incremento en la producción de virus infectivos respecto al control. En forma concordante, los niveles de ARN viral en las células incubadas con los inhibidores fueron 6 a 12 veces mayores que los detectados en el control y se observó además un aumento relativo en la acumulación de NP intracelular en los correspondientes lisados celulares. Estos datos confirmaron las observaciones obtenidas en el contexto del sistema de genética reversa, apoyando la hipótesis que PKC, o una vía de señalización dependiente de esta kinasa, regula la actividad del complejo polimerasa (NP+L) durante la replicación viral.