Construcción de vectores amplicón basados en HSV-1 para la expresión de proteínas de rotavirus humanos

PALACIOS, CARLOS; CLAUS, JUAN; MATTION, NORA

Huerta Grande, Cordoba

Congreso; XXIX Reunión Científica Anual de la Sociedad de Virología; 2009

SAV

Introducción. Rotavirus (RV), miembro de la familia Reoviridae, es la principal causa de gastroenteritis severa en niños menores de 5 años. RV posee un genoma constituido por 11 segmentos de ARN de doble cadena, que codifican para 6 proteínas estructurales (PE, VP1-VP7) y 6 no estructurales (NSP1-NSP6). Las PE denominadas VP2, VP6 y VP7, están distribuidas en un arreglo de tres capas concéntricas rodeando el genoma viral, mientras que VP4 permanece anclada a la capa externa. La co-expresión de combinaciones de proteínas estructurales ofrece la posibilidad de estudiar interacciones proteicas y la morfogénesis viral mediante el ensamblado in vivo de partículas similares a virus (VLP), además de su utilidad para el desarrollo de vacunas portando antígenos de RV. Los vectores basados en HSV-1, constituyen una herramienta interesante para co-expresar múltiples genes en células de mamífero, siendo una aproximación cercana a lo que ocurre en una infección natural y permitiría estudiar en mayor profundidad las interacciones intracelulares entre las PE y NSP. Este sistema permite la inserción de moléculas de ADN de hasta 150 kb, y es un sistema no integrativo libre de contaminación con HSV-1 infectivo. Objetivo. Construir y producir diferentes vectores amplicón derivados de HSV-1, para la co-expresión de genes de RV humano de la cepa Wa. Las combinaciones seleccionadas son: VP6/VP2 y VP7/VP4. Analizar la expresión de los genes de RV. Metodología. El plásmido amplicón tricistrónico [pHSV-Double-EGFP], contiene el promotor 4/5 de HSV-1, dos sitios de entrada de ribosoma (IRES), sitios de clonado múltiple, y el gen reportero EGFP. Estos plásmidos poseen además secuencias señal-específicas de HSV-1: empaquetamiento (pac) y origen de replicación (OriS), y son propagados en E. coli por metodología estándar. Para obtener las construcciones se amplificaron los genes estructurales de RV, y realizó el clonado molecular en el plásmido amplicón [pHSV-Double-EGFP], resultando las construcciones policistrónicas: [pHSV-VP6-VP2-EGFP] y [pHSV-VP7-VP4-EGFP]. La identidad de las construcciones se determinó por análisis de restricción y secuenciación. Los plásmidos amplicón generados fueron empaquetados en partículas de HSV-1 mediante un sistema libre de virus colaborador, en el cual todas las funciones de HSV-1 fueron aportadas en trans por un bácmido que contiene un genoma defectivo de herpes (HSV-BAC: fHSVΔpacΔ27) y una línea celular (Vero 2-2) que aporta el gen esencial ICP27. Este sistema de producción se basa en la cotransfección de las células, con el plásmido colaborador [pEBHICP27], el HSV-BAC: fHSVΔpacΔ27, y el plásmido amplicón con los transgenes de interés. Luego de 48/72 h se cosechó la monocapa infectada. La titulación de éstos vectores se realizó en monocapas de células Gli36, por conteo focos GFP+. Con las partículas obtenidas se infectaron células Vero 2-2. La expresión de las proteínas recombinantes se detectó mediante inmunofluorescencia, utilizándose microscopía de fluorescencia. Conclusiones. Los vectores amplicón expresaron y procesaron eficientemente proteínas estructurales de RV y se pudieron detectar mediante inmunofluorescencia. La expresión de antígenos que generen VLP y anticuerpos neutralizantes, es estimulante hacia la optimización de la producción de estos vectores para posteriores estudios tanto en el área de vacunas, como en la biología del sistema inmune frente a infecciones por RV.