Construcción de un clon infecciosos y un replicón del virus de la Fiebre Aftosa

GIRALDEZ ADRIAN; D'ANTUONO, ALEJANDRA; LA TORRE, JOSE; MATTION, NORA

Huerta grande, Cordoba

Congreso; XXIX Reunión Científica Anual de la Sociedad de Virología; 2009

SAV

El virus de la fiebre aftosa (VFA) es un Picornavirus que posee un genoma de ARN simple cadena de polaridad positiva de aproximadamente 8.200 bases, que codifica para una poliproteína de 2.332 aminoácidos. El VFA es un agente infeccioso de alta relevancia a nivel mundial por los daños económicos que produce y es por ello que el avance en el conocimiento de este virus es de gran importancia, tanto para el diseño de nuevas vacunas como para la prevención y/o contención de posibles brotes. Objetivos: El objetivo del trabajo es construir un sistema de genética reversa basado en un replicón del VFA y su utilización como herramienta en el estudio del ciclo de replicación viral. Materiales y métodos: La estrategia general consistió en la amplificación por RT-PCR de la totalidad del genoma de VFA en cuatro segmentos y su posterior ensamblado (excluido el tracto de policitosinas). Como templado se utilizó el ARN del VFA serotipo O1 Campos y para los clonados y subclonados solo se utilizaron sitios de restricción presentes naturalmente en la secuencia del genoma viral. En una primera etapa se ensamblaron por separado las mitades 3’ terminal (nt 3006-8168) y 5’ terminal (nt 1-3006) del genoma viral. A esta última se le agregó el tracto de poliC (20 citosinas) a un segmento acotado de la zona 5’ terminal, y posteriormente se reconstruyó el segmento 5’ terminal incluyendo el tracto de poliC. Finalmente, se ensamblaron las dos mitades para obtener el clon completo (VFA ADNc). La transcripción del VFA ADNc está bajo el promotor T7, y previamente se linealiza con un sitio único de corte para la enzima de restricción EcoRV que agrega solo dos nucleótidos río abajo de la cola de poliA. Para hacer posible su utilización en laboratorios sin bioseguridad NBS3A, se construyó un replicón derivado de VFA ADNAc donde se reemplazó la región comprendida entre el aa 265 de VP0 hasta el aa 173 de VP1, por el gen reportero luciferasa (VFA ADNc::luc). Finalmente se analizó la habilidad de VFA ADNc::luc para dirigir la transcripción del replicón en células susceptibles y la expresión de proteínas no estructurales. Para ello se cotransfectaron células BHK -21 con el VFA ADNc::luc y el vector pT7 (sobreexpresa la polimerasa T7). Para evaluar la capacidad replicativa, a diferentes tiempos post-transfección se extrajo ARN total y se realizaron reacciones de RT-PCR utilizando primers dirigidos a la hebra negativa. Para evaluar la habilidad de expresar las proteínas no estructurales del VFA, a las 24 hpt, se analizó por western blot la presencia de 3A y 3C en extractos celulares totales. Conclusiones: Se concluyó exitosamente el ensamblado del clon sin introducir inserciones, deleciones, ni mutaciones durante su construcción. Se comprobó la capacidad replicativa del replicón en células BHK-21 y, posteriormente, en un laboratorio de bioseguridad NBS3A se evaluará el funcionamiento del clon infeccioso. La obtención de esta herramienta nos permitirá estudiar a nivel molecular las diferentes funciones que cumplen tanto las proteínas virales como distintas estructuras presentes en zonas no codificantes del genoma, en el ciclo viral y en la interacción con el huésped.