Análisis de las regiones/aminoácidos implicados en la interacción entre la proteína Z y la Nucleoproteína, relevantes para la formación de partículas de tipo viral en arenavirus

LEVINGSTON MAC LEOD, JESICA MARIANA; CASABONA, JUAN CRUZ; GÓMEZ, GUILLERMO; LOUREIRO, MARÍA EUGENIA; LÓPEZ, NORA.

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virologia

El virus Tacaribe (VTac) es el prototipo de los arenavirus delNuevo Mundo y conforma un linaje filogenético con los patógenosproductores de fiebres hemorrágicas conocidos en Sudamérica, entrelos que se cuenta el virus Junín (VJun). Los arenavirus son virusenvueltos, cuyo genoma está constituido por dos segmentos de ARNde cadena simple (llamados S y L). El ARN S codifica para lanucleoproteína (N) y para el precursor de las glicoproteínas de envoltura(GPC). El ARN L codifica para una ARN polimerasa ARNdependiente (proteína L) y para la proteína Z, que contiene un dominioRING. Los ARNs genómicos están asociados a la proteína N formandolas ribonucleoproteínas (RNPs), las cuales son el templadopara la transcripción y la replicación del ARN viral. La proteína Z tieneun rol central en la morfogénesis viral y se ha demostrado quepuede inducir la formación de partículas de tipo viral (PTVs), cuandose la expresa en células eucariotas en ausencia del resto de los componentesvirales. Nuestro grupo ha desarrollado un sistema degenética reversa que dirige la replicación y la incorporación de unminigenoma a PTVs, en células que expresan un ARN análogo alARN S de VTac, las proteínas L y N de VTac y las proteínas Z y GPCde VJun, a partir de plásmidos transfectados. Utilizando este sistema,hemos encontrando previamente que Z es la única proteína viralimplicada en la incorporación de N a las PTVs. Mas aun, en célulasque expresan únicamente Z y N, encontramos que N es incorporadaa las PTVs donde se encuentra protegida por una envoltura lipídica.Con el objetivo de identificar los aminoácidos (aa)/motivos de Zinvolucrados en la incorporación de N a las PTVs, generamos unaserie de mutantes puntuales de Z. Las PTVs formadas luego de lacoexpresión de las mutantes de Z con la proteína N se analizaron porWestern blot. Además, las mutantes de Z fueron ensayadas en elcontexto del sistema completo, en el cual la presencia de RNPs enlas PTVs obtenidas se analizó mediante ensayos de infección. Lasposibles interacciones entre las mutantes de Z o la proteína Z salvajey N fueron analizadas por microscopia confocal y mediante ensayosde coinmunoprecipitación. Por otra parte, iniciamos el mapeo de lasregiones de N involucradas en la interacción con Z. Con tal fin, segeneraron mutantes por deleción de la proteína N. Se ensayó la incorporacióna PTVs de las mutantes de N luego de la coexpresión con Z.Además, se realizó el análisis funcional de las mutantes de N en elcontexto del sistema de genética reversa. Los datos obtenidos indicanque los residuos L49 y L79 así como la integridad de la estructura RINGen Z, son esenciales para: i) la transferencia del minigenoma a célulasfrescas por las PTVs producidas en el sistema completo, ii) la incorporaciónde N a PTVs obtenidas luego de la coexpresión de N y Zen ausencia de otros componentes del sistema y iii) para la interacciónentre N y Z. Los resultados indican además que el extremo C-terminalsería la región de N involucrada en la incorporación de esta proteína alas PTVs. CONCLUSION: Nuestros resultados sustentan la hipótesisde la incorporación de las nucleocápsides a las partículas virales enforma dependiente de la interacción entre N y Z.