La región N-terminal de la proteína 3A del virus de la fiebre aftosa posee dominios esenciales para la replicación/transcripción viral.

PR GRIGERA; CM LOTUFO; NM MATTION; M WILDA

Rosario, Santa Fe, Argentina

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología ALAM-CAM 2016, IV Congreso Latinoamericano de Microbiología de Medicamentos y Cosméticos; 2016

Sociedad Argentina de Microbiologia

Best Poster PrizeLa Fiebre Aftosa es una enfermedad vesicular aguda que afecta a animales rumiantes biungulados, de amplio rango de huésped y rápida propagación. El agente causal es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un virus no envuelto con genoma ARN de polaridad positivaperteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para 4 proteínas estructurales y 8 proteínas no estructurales, entre estas últimas se encuentra la proteína 3A de 153 aminoácidos (aa) de longitud. Esta proteína posee en la región N-terminal un dominio constituido por dos alfa hélices (aa 25-44) y una región hidrofóbica predicta en la mitad de la molécula (aa 57-76).Se ha reportado que 3A juega un papel relevante en la síntesis del ARN, en el anclaje a membranas intracelulares del complejo replicativo, en el grado de virulencia y rango de huésped del VFA. La mayor parte de los estudios se han realizado sobre el dominio C-terminal. Se propuso identificar en 3A dominios involucrados en la replicación/transcripción a través de mutaciones generadas sobre un replicón del VFA basado en la cepa O1/Campos (pRep).El plásmido pRep, bajo regulación del promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol) codifica la región completa de proteínas no estructurales del virus, y los extremos no traducibles, pero las proteínas capsidales fueron reemplazadas por el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga. Se construyó también un replicón defectivo que genera un transcripto no funcional (pRepD).Se realizaron deleciones sobre pRep en la región N-terminal de 3A, resultando las mutantes: p∆6-11, p∆6-17 y p∆6-23, y posteriormente se realizaron mutaciones puntuales en la región. Se cotransfectaron células BHK-21 con los plásmidos mutantes o controles, junto con los plásmidos que expresan T7pol y luciferasa renila (normalizador). A las 16hs post-transfección se midió la actividad luciferasa (luciérnaga y renila) utilizando el Dual-Luciferase Assay System?. Por otro lado, se construyó un mutante con la deleción total de la zona que funcionaría como dominio transmembrana (aa 57-76) y sería responsable del anclaje del complejo replicativo viral en las membranas intracelulares. La ubicación intracelular de los replicones que contienen 3A wild type (wt) o las mutantes delecionadas se realizó mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta.Las mutantes p∆6-11 yp∆6-17 presentaron actividades de luciferasa similares a pRep con 3A wt ,mientras que p∆6-23 presentó una marcada disminución en dicha actividad. A partir de estos datos se crearon otras dos mutantes, una con reemplazo de los aa 18-20 por Alaninas (pQ18A/H19A/E20A) y otra con reemplazo del único aa con carga negativa de la zona (pE20A). En ambos casos se observó una disminución significativa de la actividad de luciferasa. Se concluye que la región comprendida entre los aa 18-23 y particularmente el Acido Glutámico en la posición 20 poseen un rol esencial en la replicación viral.