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Introducción El género Brugmansia pertenece a la familia Solanáceas, incluye seis especies sudamericanas, propias de la región andina; B. arborea., B. aurea., B. sanguinea B. suaveolens, B. versicolor y B. x candida (híbrido natural entre B. aurea y B. versicolor). Se caracterizan por ser arbustos o árboles pequeños de 2 a 5 m. de altura; de hojas grandes de 10 23 x 4 11 cm. Flores usualmente fragantes, péndulas o inclinadas; cáliz con 2 5 dientes, desiguales en longitud, a veces con aspecto espatiforme. Corola blanca o roja, menos frecuentemente amarillo o rojizo, de forma acampanada, de 15 30 (43) cm longitud; sus pétalos terminan en 5 dientes recurvos o revolutos de diferente longitud, según la especie (Hunziker, 2001). Si bien existen descripciones botánicas muy detalladas de cada una de las especies, su identificación implica una difícil tarea, dado que sus flores poseen una amplia variedad de formas, tamaños y colores, los cuales cambian drásticamente entre los lugares de crecimiento (ABADS, 2003). También se observan modificaciones en la forma y tamaño de sus hojas, posiblemente debido a infecciones virales (Hawkes et al., 1991) Dado que las características fenotípicas evaluadas a partir de la simple inspección visual no permiten diferenciar entre especies, se requieren estudios más detallados que permitan establecer la identidad del individuo a partir del cual podrían realizarse cruzamientos a fin de obtener nuevas variedades con aquellas características deseadas por en el mercado. Para ellos se propone utilizar la caracterización molecular mediante marcadores ISSR (inter-simple sequence repeat), comúnmente denominados microsatélites anclados, que permiten realizar un fingerprint de los individuos analizados, garantizando su identificación. Este método es mediado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en el cual se utilizan como iniciadores secuencias repetitivas complementarias a microsatélites cercanos y en orientaciones opuestas (Zietkiewicz, E., et al., 1994); los iniciadores diseñados poseen una secuencia de anclaje de 1 a 3 nucleótidos en el extremo 3´ o 5´, que elimina posibles bandas inespecíficas. Los ISSR se caracterizan por ser marcadores dominantes y multialélicos. Objetivo El objetivo del presente trabajo es llevar a cabo la puesta a punto de las condiciones óptimas de la reacción de PCR para cada uno de los iniciadores a ser utilizados. A partir de dichas condiciones, en el futuro, se podrán caracterizar las especies del género Brugmansia y establecer la diversidad genética de la que se dispone para iniciar programas de mejoramiento vegetal. Materiales y Métodos Material Vegetal: Se analizaron dos ejemplares de la especie B. x candida; un ejemplar de B. arborea y otro de B. suaveolens. Las especies fueron elegidas como representantes del género en la Argentina de acuerdo con la información recabada entre los jardines botánicos ubicados en las zonas templadas a cálidas del país (desde Buenos Aires a Jujuy). Extracción del ADN: La extracción de ADN se realizó a partir de hojas jóvenes liofilizadas de cada uno de los ejemplares colectados según la técnica de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) con modificaciones. La calidad y cantidad de ADN extraído fue verificada en un gel de agarosa al 0,8 % (en TAE 1X con Bromuro de etidio 0,01 mg/ml). La concentración obtenida de cada muestra fue calculada por comparación con masas conocidas del marcador de peso molecular λ / Hind III (PB-L- UNQ) PCR: Se utilizaron 8 iniciadores (Tabla 1). La reacción de amplificación se llevó a cabo con 30 ng de ADN molde, 2,5 µl de buffer de reacción 10X; 0,2 mM de dNTP´s; 0,8 µM iniciadores; se realizó un gradiente de concentración de Mg2Cl 25 mM entre 1,5 a 3 mM y 0,5 U de Taq polimerasa (Inbio Highway); volumen final 25 µl. Se utilizó un termociclador programable BioRad con gradiente de temperatura. Las condiciones de PCR utilizadas fueron: 1- Desnaturalización inicial, 94 ºC por 90 seg.; 2- 40 ciclos de: 40 seg. a 94 ºC, 45 seg. a la temperatura de hibridación de cada iniciador; la misma se obtuvo realizando un gradiente de temperatura a partir de la temperatura de melting menos 4 ºC (Tabla 1) y 90 seg. a 72 ºC; 3- Extensión final, 72 ºC por 10 minutos. Los resultados fueron evaluados en un gel de agarosa al 2,5 % (en TAE 1X con Bromuro de etidio 0,05 mg/ml), con un tiempo promedio de corrida de 4 hs a 80 V. Resultados y Discusión Extracción del ADN: Como resultado del protocolo de extracción se obtuvo de cada una de las muestras una buena cantidad y calidad de ADN. A partir de las concentraciones obtenidas se realizaron diluciones a fin de lograr la concentración adecuada para realizar las PCRs; a modo de ejemplo se presenta la Figura 1, en la cual se expone concentración inicial obtenida y una serie de diluciones de la muestra correspondiente a B. x candida. * Figura 1: ADN de B. x candida. Se presentan de izquierda a derecha la concentración inicial obtenida y las diluciones en serie a partir de la misma. * Indica la muestra elegida para realizar las PCR. (Marcador de peso molecular: λ Hind III) PCR: Los resultados de la evaluación de los gradientes de temperatura de hibridación y de concentración de MgCl2 para cada uno de los iniciadores se resumen en la Tabla 1. La elección de cada condición se realizó en función del patrón de bandas obtenido. En la Figura 2 se exponen, a modo de ejemplo, los resultados para el gradiente de MgCl2 del iniciador 3´AC y los gradientes de temperatura de 3´TG y 3´GGG. Conclusiones El protocolo de extracción de ADN propuesto resulta muy eficiente dada la calidad y cantidad obtenida. Estos primeros avances en la puesta a punto de las condiciones de la reacción de PCR para los ocho iniciadores propuestos permitirán iniciar los estudios de caracterización del género Brugmansia sp. Tabla 1: Resultados del gradiente de temperatura y concentración de MgCl2 para cada iniciador. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gradiente MgCl2 3´AC Gradiente Temp. 3´ TG Gradiente Temp. 3´ GGG * * * Nombre Secuencia Temp. melting Temp. Hibridación Cc. MgCl2 [mM] 3´GGG GGG(TGGG)2 TG 64 ºC 59 ºC 3 5´GACA TC (GACA)4 57 ºC 54 ºC 3 3´CAG (CAC)5 AT 59 ºC 55 ºC 3 3´AG (AG)8 C 57 ºC 52 ºC 3 3´TG (TG)8 A 54 ºC 50 ºC 3 3´AC (AC)8 G 57 ºC 53 ºC 2,5 3´TC (TC)8 A 54 ºC 48 ºC