MAPEO DEL SITIO DE UNIÓN DEL ANTICUERPO MONOCLONAL MAB 3H7 A LA PROTEÍNA NO ESTRUCTURAL 3A DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA (VFA)

CM LOTUFO; M WILDA; C SEKI; NM MATTION; PR GRIGERA

CABA

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

Asociación Argentina de Microbiología

Introducción: La fiebre aftosa (FA), causada por el virus de fiebre aftosa (VFA), familia Picornaviridae, es una enfermedad altamente contagiosa y con potencial para generar graves pérdidas económicas en la industria ganadera de animales rumiantes biungulados. La campaña sanitaria de control del VFA implementada en la Argentina (2000-2002), fue enormemente asistida por el test 3ABC-ELISA que detecta anticuerpos reactivos, elaborado nuestro instituto, y utilizado para asistir a la autoridad sanitaria local y regional hasta la actualidad. El genoma del VFA codifica para 4 proteínas estructurales y 8 proteínas no estructurales (NS) todas producidas intracelularmente, y expuestas al sistema inmune del animal. Entre las NS se encuentra la proteína 3A, que se cree juega un papel relevante en la síntesis del ARN viral a través del anclaje del complejo replicativo a membranas intracelulares y está directamente relacionada con el grado de virulencia del VFA. La secuencia de 3A también corresponde al N-terminal de la proteína 3ABC recombinante utilizada por nuestro laboratorio como inmunógeno para generar el MAb3H7, reactivo clave en el desarrollo del test 3ABC-ELISA utilizado para diferenciar animales infectados de vacunados. Objetivo: Nos proponemos mapear el sitio de unión de MAb3H7 a la proteína 3A con precisión de 5-10 aa y utilizar péptidos conteniendo la secuencia del epítope para diversos estudios básicos y aplicados. Entre ellos, el diseño de un 3ABC-ELISA de competencia optimizado en su sensibilidad para detectar actividad anti-3ABC en suero de animales.Metodologías y Resultados: Mapeo de las secuencias reactivas con MAb3H7: se clonó el segmento 3ABC, el cual contiene una mutación puntual en el sitio activo de proteasa que neutraliza la actividad autoprocesadora de 3ABC, en el vector de expresión pET-30A. Se realizaron 7 deleciones secuenciales en el extremo 3' del gen 3ABC utilizando PCR con primers específicos. Los fragmentos fueron clonados en pET-30A y expresados en E.coli BL21. Los correspondientes lisados de expresión fueron evaluados en paralelo por inmunoblot (Western Blot) utilizando como referencia un anticuerpo monoclonal anti-proteína 3C, para normalizar los niveles de expresión y el anticuerpo monoclonal MAb3H7, para diferenciar secuencias reactivas y no reactivas. Los resultados muestran con claridad que el Mab3H7 es solo capaz de unirse a la secuencia completa de 3ABC y a ninguno de los fragmentos de 3ABC secuencialmente deletados en su N terminal. Conclusión: Se concluye que el epítope específico reactivo con MAb3H7 mapea en los primeros 20 aa de la proteina 3A. Estos corresponden a la secuencia NH2-ISIPSQKSVLYFLIEKGQH-COOH. Al momento de este informe se esta testeando la actividad de MAb3H7 contra los peptidos 3Apep1 (SIPSQKSVL), 3Apep2 (QKSVLYFLI) y 3Apep3 (YFLIEKGQH) contenidos en la secuencia mencionada con el objeto de precisar el epítope y definir la secuencia a ser usada en un test de ELISA-3ABC de competencia mencionado.