Expresión de pretrombina recombinante en cultivos in vitro de Nicotiana tabacum

MELINA LAGUÍA BECHER; PATRICIA MARCONI; VALERIA RICCO; MARÍA ALEJANDRA ALVAREZ

Asunción

Congreso; XV Simposio Latinoamericano de Farmacobotánica I Congreso Paraguayo de Farmacobotánica; 2015

Sociedad Científica del Paraguay

Introducción: La producción de proteínas recombinantes en vegetales, y en particular en cultivos in vitro, resulta atractiva porque las células vegetales poseen la maquinaria biosintética adecuada y por razones de bioseguridad (ausencia de agentes patógenos humanos como oncogenes, priones, toxinas). Objetivos: el objetivo de este trabajo fue expresar pretrombina recombinante tanto de manera transitoria como de manera estable en cultivos in vitro de Nicotiana tabacum. Materiales y Métodos: se diseñaron dos constructos con la secuencia codificante del factor II humano (864 pb) bajo el control del promotor CaMV35S fusionado a la secuencia señal 2S2 de Arabidopsis thaliana para direccionar la proteína a la vía secretora. Se construyeron dos versiones, con o sin el agregado la secuencia KDEL de retención en retículo endoplasmático, se obtuvo la versión de secreción a apoplasto (pFII-A) y la de retención en retículo endoplasmático (pFII-RE). Los constructos se introdujeron en los vectores binarios de expresión en vegetales pK7WG2 y p35 SGAT y éstos en Agrobacterium tumefaciens con el que se agroinfiltró plantas jóvenes de N. tabacum. Para evidenciar si existe o no silenciamiento génico (PTGS) se cotransformó con CP-TCV. Una vez confirmada la expresión transitoria se procedió a la transformación estable. Hojas de plantas agroinfiltadas fueron separadas luego de 4 días post-agroinfiltración, esterilizadas e incubadas en medio MS sólido conteniendo ácido α‐naftalenacético (2 mg/L) y kinetina (0,2 mg/L) y los antibióticos kanamicina (50 mg/L) y carbenicilina (500 mg/L). Luego se transfirieron a medio sin antibióticos y se analizó por PCR la presencia del transgen FII. Las líneas que expresaban fueron transferidas a medio líquido en Erlenmeyers agitados y luego a un bioreactor Minifors®.Resultados: el Western blot mostró una banda específica para FII de aproximadamente 35 kDa en la versión pFII-RE, independientemente de la presencia del supresor del PTGS CP-TCV. En la versión pFII-A se detectó en los extractos de hojas co-agroinfiltradas con CP-TCV. En cultivos en bioreactores el nivel máximo alcanzado en pFII-A fue de 27.59 g FII/ g PTS en la biomasa y el rendimiento máximo fue de 4.64 g FII/g PTS en el medio de cultivo.