Obtención de un clon infeccioso para el arenavirus Tacaribe

FOSACALDI, S; LOUREIRO E; D'ANTUONO A; LÓPEZ N

Buenos Aires

Congreso; II Congreso Latinoamericano de Virología- XI Congreso Argentino de Virología (CAV 2015); 2015

Sociedad Argentina de Virología

La familia Arenaviridae incluye virus productores de fiebres hemorrágicas en humanos, tales como el virus Junin, así como virus no patógenos como el virus Tacaribe (TCRV), prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo. TCRV es un virus envuelto, cuyo genoma está constituido por dos segmentos de ARN de cadena simple (llamados S y L). Ambos segmentos usan una estrategia ambisentido para codificar dos proteínas: la nucleoproteína (NP) y el precursor (GPC) de las glicoproteínas de envoltura en el ARN S;  la ARN polimerasa viral (L) y la proteína Z, esencial para la morfogénesis viral, en el ARN L. Las proteínas NP y L son necesarias y suficientes para sostener la transcripción y replicación del genoma viral. En este trabajo hemos generado un sistema de genética reversa para la obtención de TCRV infeccioso a partir de plásmidos transfectados en células de mamífero. En primer lugar, se construyeron los plásmidos pSag y pLagWT que expresan, respectivamente, la copia complementaria completa del ARN S y del ARN L de TCRV bajo el control del promotor de la ARN polimerasa del fago T7 (T7Pol). Construimos además dos plásmido derivados del pSag, denominados pSagGFP y pSagCherry, que contienen el gen de la proteína fluorescente GFP o mCherry en remplazo del gen GPC o NP, respectivamente. También se generó un plásmido control, pLag_pol(-), que contiene dos cambios puntuales en el ORF de L que inhiben su actividad polimerasa. Para evaluar estas construcciones se emplearon células BHK-T7, que expresan la T7Pol en forma constitutiva. Las células fueron transfectadas con distintas cantidades de los plásmidos pSag GFP o pSagCherry junto con pLagWT. Se evaluó paralelamente el efecto de la adición a la mezcla de transfección de los plásmidos pNP y/o pL, que expresan las proteínas NP y L, respectivamente. Los resultados mostraron la acumulación de la correspondiente proteína fluorescente (GFP o mCherry) en las células cotransfectadas con pLagWT. Además, la adición de pL resultó en un incremento de la señal fluorescente. En contraste, como se esperaba, no se detectó fluorescencia en las células cotransfectadas con pLag_pol(-). Estos resultados indicaron que el ARN transcripto a partir de los plásmidos pSagGFP o pSagCherry fue efectivamente transcripto y replicado. Con el fin de obtener virus infeccioso, células BHK-T7 fueron transfectadas con las cantidades y proporciones óptimas de los plásmidos pSag, pLagWT y pL determinadas previamente. La titulación de los sobrenadantes celulares colectados luego de 72 hs de incubación, indicó la presencia de 102 pfu/ml de TCRV infeccioso. Luego de 4 pasajes de los sobrenadantes en células BHK, se logró amplificar el stock viral obteniéndose un titulo de 106 PFU/ml. La generación de TCRV recombinante constituye una valiosa herramienta para el estudio de diversos aspectos de la biología de los arenavirus a nivel molecular, en el contexto de una autentica infección.