Requerimientos para la incorporación de las glicoproteínas a partículas de tipo viral de arenavirus”

CASABONA, JUAN CRUZ; LEVINGSTON MAC LEOD, JESICA MARIANA, NUNBERG, JACK; LÓPEZ, NORA.

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virologia

El virus Tacaribe (VTac) es el prototipo de los arenavirus del “NuevoMundo”, grupo que incluye los 5 patógenos productores de fiebreshemorrágicas conocidos en Sudamérica: los virus Junín (VJun),Machupo, Guanarito, Sabia y Chapare. El genoma de VTac poseedos segmentos de ARN de simple cadena, denominados L y S. Enel segmento L, se encuentran codificadas la proteína L (ARN polimerasaviral) y una pequeña proteína llamada Z, la cual posee un rolcentral en la brotación de las partículas virales. El segmento S codificapara la nucleoproteína (N) y para el precursor (GPC) de lasglicoproteínas de envoltura. El precursor GPC es procesado en formaposttraduccional por proteasas celulares en tres unidades que,asociadas mediante interacciones no covalentes, conforman el complejoglicoproteico maduro. Estas unidades son: el péptido señal (SP),que es miristilado e intervendría en el tráfico intracelular de GPC, laproteína G1 que estaría involucrada en el reconocimiento de receptorescelulares, y G2 que participaría en la fusión de la envoltura delvirión con la membrana de la célula infectada. A su vez, en G2 sedefinen tres regiones: la región ectocitoplásmatica, la región transmembrana(TM) y el dominio citoplasmático (CTD). Con el objetivode estudiar las bases moleculares de la morfogénesis de arenavirus,nuestro grupo ha desarrollado un sistema de genética reversa basadoen la coexpresión (a partir de plásmidos transfectados) de lasproteínas L y N de VTac y Z y G de VJun, en conjunto con un minigenomaanálogo al ARN S de VTac (MG). Este sistema reconstituyela transcripción, la replicación y la incorporación del MG a partículasde tipo viral (PTVs). En este trabajo, analizamos los requerimientospara la incorporación de las glicoproteínas a PTVs. Para eso, lascélulas transfectadas fueron marcadas con precursores radioactivos.Los sobrenadantes celulares fueron colectados y las PTVs producidasfueron concentradas por ultracentrifugación y analizadas en formaparalela con los lisados celulares por Inmunoprecipitación (IP).Los resultados indicaron que la eficiencia de incorporación de lasglicoproteínas a PTVs, medida como la relación entre la cantidad deG1 y la de Z incorporadas, fue de 5 a 10 veces mayor en PTVs producidaspor células en las que GPC fue coexpresada con Z y N, respectoa las producidas en células en las que GPC y Z fueroncoexpresadas en ausencia de N. Para comenzar a definir los motivosimplicados en la incorporación de las glicoproteínas a PTVs, seevaluaron mutantes de GPC con modificaciones en los motivos relevantespara la biogénesis del complejo glicoproteico maduro. Se utilizóuna mutante (G2A) que contiene una substitución que impide lamiristilación del SP, así como una mutante con modificaciones en lasecuencia consenso de clivaje del precursor GPC a G1 y G2. Por otraparte, se construyeron mutantes con deleciones en la zona carboxiterminalde G2, así como también una quimera en la cual se reemplazóla zona CTD de VJun por la correspondiente a la glicoproteínade membrana CD4. En primer lugar se analizó la expresión de losGPC mutantes por IP e inmunofluorescencia indirecta. Posteriormente,se evaluó tanto la incorporación de las diferentes glicoproteínasmutantes a PTVs marcadas por IP, así como la capacidad de lasmismas de mediar la transferencia del MG a nuevas células en ensayosde infección. CONCLUSION: Los resultados obtenidos indicanque la miristilación del precursor GPC o el correcto procesamientodel mismo a G1 y G2, no conforman un requisito indispensable parala incorporación de las glicoproteínas a las PTVs. Por otro lado, sediscutirá la importancia de las regiones TM y CTD de GPC para elcorrecto ensamblado e infectividad de las PTVs.