- “Estudio de la función de la proteína Z en la incorporación de la nucleoproteína a partículas de tipo viral, generadas en un sistema de genética reversa para arenavirus”.

JESICA LEVINGSTON, JC CASABONA, EUGENIA LOUREIRO, GUILLERMO GÓMEZ Y N. LÓPEZ.

Vaquerías, Pcia. de Córdoba

Otro; XXVII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología. Diciembre 2007.; 2007

Sociedad Argentina de Virología

El virus Tacaribe  (VTac) es el prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo y conforma un único linaje filogenético con los patógenos productores de fiebres hemorrágicas de Sudamérica: los virus Junín, Machupo, Guanarito y Sabia. Los arenavirus son virus envueltos, cuyo genoma está constituido por dos segmentos de ARN de cadena simple (llamados S y L). El ARN S codifica para la nucleoproteína (N) y para el precursor de las glicoproteínas de envoltura (GPC). El ARN L codifica para una ARN polimerasa ARN dependiente (proteína L) y para la proteína Z. Los ARNs genómicos están estrechamente asociados a la proteína N formando las ribonucleoproteínas (RNPs), las cuales son el templado para la transcripción y la replicación del ARN viral. La proteína Z tiene un rol central en la morfogénesis viral y se ha demostrado para otros arenavirus que puede inducir la formación de partículas de tipo viral (PTVs), cuando se la expresa en células eucariotas en ausencia del resto de los componentes virales. Tomando como modelo de arenavirus del Nuevo Mundo al VTac, nuestro grupo ha desarrollado un sistema de genética reversa que permite recrear todas las funciones virales. Este sistema dirige la replicación y la incorporación de un minigenoma a PTVs, en células que expresan un ARN análogo al ARN S y las proteínas virales recombinantes a partir de plásmidos transfectados. Utilizando este sistema, aquí demostramos por análisis de western blot, que Z es esencial para la incorporación de N a  PTVs purificadas del sobrenadante de células transfectadas, independientemente de la coexpresión del minigenoma y de la proteína GPC. Mas aun, la coexpresión de Z y N en ausencia de otros componentes virales condujo a la formación de PTVs que, por ensayos de protección a proteasas,  demostramos que contienen  Z y N protegidas por la envoltura lipídica. En ausencia de coexpresión de Z, N no fué recuperada en la fracción particulada del sobrenadante de cultivo. Por otro lado, la observación de las células transfectadas por inmunofluorescencia y microscopía confocal reveló la colocalización de Z y N a nivel de la membrana plasmática, que se conoce como el sitio de brotación de las partículas de arenavirus. Para identificar los aminoácidos/motivos de Z involucrados en la incorporación de N a las PTVs, generamos una serie de mutantes puntuales de Z. Las PTVs formadas luego de la coexpresión de las mutantes de Z con la proteína N se analizaron por western blot. Además, se estudió la localización intracelular de las mutantes expresadas en forma solitaria o coexpresadas con N. Por ultimo, se ensayó la capacidad de las mutantes de Z de mediar la transferencia del minigenoma a células nuevas, por ensayos de infección con las PTVs producidas en el contexto del sistema completo. Los datos obtenidos demuestran que Z es el único componente del sistema implicado en la incorporación de N a las PTVs y sugieren que la incorporación de las RNPs a las partículas virales dependería de la interacción entre N y Z.