Construcción de un replicon para el virus de la fiebre aftosa y análisis de la región N-terminal de 3A en la replicación/transcripción.

LOTUFO, CECILIA; WILDA, MAXIMILIANO; GRIGERA, PABLO; MATTION, NORA

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología, CAV 2015, II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

AAM

Introducción La fiebre aftosa es una enfermedad vesicular aguda que afecta a animales rumiantes biungulados, de amplio rango de propagación. El agente causal es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un virus no envuelto con genoma ARN de polaridad positiva perteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para 4 proteínas estructurales y 8 proteínas no estructurales, entre estás últimas se encuentra la proteína 3A de 153 aa de longitud. Esta posee un dominio hidrofóbico N-terminal (aa 25-44) y un dominio hidrofóbico transmembrana (aa 57-76). Se cree que 3A juega un papel relevante en la síntesis del ARN y en el anclaje a membranas intracelulares del complejo replicativo, como también en el grado de virulencia y rango de huésped del VFA. Objetivos Generar por medio de genética reversa, un replicón que pueda ser usado en laboratorios de seguridad mínima y permita el estudio de los componentes de la replicación y transcripción viral, de las proteínas no estructurales, así como de las regiones 3´ y 5´ no codificantes. Identificar en 3A dominios involucrados en la replicación/transcripción a través de mutaciones generadas en el replicón sobre el correspondiente gen. Metodologías Se diseñó y construyó un replicón plasmídico basado en una copia de ADN del genoma completo del VFA de la cepa O1/Campos, en el cual se le reemplazaron las proteínas capsidales por el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga (pRep), bajo regulación del promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol). Como control de la actividad replicativa de pRep, se construyó un replicón defectivo del mismo por medio de una deleción de 1 nt la cual genera un transcripto no funcional (pRepD). Para la medición de la actividad luciferasa del replicón y su control células BHK-21 se cotransfectaron con los plásmdos pRep o pRepD junto con los plásmidos que expresan T7 polimerasa y luciferasa renila (normalizador). Se obtuvieron lisados celulares a 8,16 y 24 hs post-transfección (pt) y la actividad luciferasa (luciérnaga y renilla) de los mismos se midió utilizando el Dual-Luciferase Assay System? (Promega) con un luminómetro BioTek FLx800. Para el estudio de 3A se realizaron deleciones sobre pRep en la región que codifica para el extremo N terminal, resultando las mutantes: pΔ6-11, pΔ6-17 y pΔ6-23 fueron evaluadas utilizando la misma metodología junto con pRep y su control pRepD a 16hs pt. Resultados Se logró la construcción del Replicón del VFA O1/Campos con capacidad de trascripción/replicación medible a través de la actividad luciferasa, obteniéndose la mayor actividad a las 16hs. Las mutantes pΔ6-11 y pΔ6-17 presentaron actividades de luciferasa similares a pRep, planteando que la región comprendida entre los aa 6 a 17 de 3A no sería necesaria para la funcionalidad del mismo. Por el contrario, pΔ6-23 presentó una disminución en dicha actividad, sugiriendo que los aa 18 a 23 de 3A podría estar involucrados en los eventos de replicación/transcripción.