Importancia de las regiones no codificantes en la regulación de la traducción de los ARN mensajeros de arenavirus

FOSCALDI SABRINA; ALEJANDRA DANTUONO; LOPEZ NORA

Buenos Aires

Jornada; XXXIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2013

Sociedad Argentina de Virologia

El genoma de los arenavirus codifica para cuatro proteínas que se expresan a partir de ARN mensajeros (ARNm) subgenómicos. Estos ARNm poseen estructura Cap en su extremo 5? y contienen una región 3? no codificante, carente de poliA, cuya estructura secundaria predicha es muy estable. Usando como modelo de estudio al virus Tacaribe (TCRV), un arenavirus no patógeno muy relacionado antigénica y genéticamente con el virus Junín, previamente estudiamos la participación de las regiones no codificantes (RNC) de los ARNm en su traducción. Para ello se generaron plásmidos portadores del marco abierto de lectura de la proteína reportera Firefly Luciferasa (FLUC) flanqueado por las RNC 5´ y 3´ salvajes o mutadas. A partir de los mismos, se crearon transcriptos con las características de un ARNm viral o transcriptos mutantes, respectivamente, mediante transcripción in vitro en presencia del análogo de Cap m7GpppA. Los ARNm sintéticos fueron transfectados en células eucariotas y la traducción del gen reportero fue evaluada mediante la determinación de la actividad de FLUC en los lisados celulares. Se observó que los niveles de actividad FLUC obtenidos para transcriptos con deleción parcial de las RNC 5? o 3? fueron de 3 a 5 veces menores que los medidos para el transcripto salvaje. Para establecer si esos resultados reflejan diferencias en la eficiencia de traducción o son consecuencia de una relativa menor estabilidad de los ARNm mutantes, se analizó la variación de los niveles intracelulares de ARNm durante el tiempo experimental empleado. Para eso, los transcriptos salvaje o mutantes fueron transfectados por triplicado en células eucariotas. Se extrajo ARN total al finalizar la transfección (tiempo CERO) y 4 horas más tarde, cuando se realizó la medición de actividad FLUC. Se generaron ADN copia con oligonucleótidos específicos para la amplificación posterior de un fragmento del gen blanco FLUC o del gen endógeno de referencia gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) por medio de PCR en tiempo real. A partir de los valores obtenidos, se calculó la proporción R para cada transcripto, que representa la cantidad de ARNm blanco al final del experimento con respecto a su valor a tiempo CERO. Los resultados mostraron que el R de los transcriptos mutantes fue similar al del transcripto salvaje, indicando que las diferencias de expresión de FLUC a partir de los mutantes no estarían dadas por una mayor inestabilidad de éstos respecto al ARNm salvaje. En conclusión, nuestros resultados apoyan la idea de que las RNC 5´ y 3´ poseen determinantes necesarios para la traducción eficiente de los ARNm de TCRV. La naturaleza de dichos determinantes será definida mediante un nuevo grupo de transcriptos mutantes, actualmente en construcción, en los que las RNC serán reemplazadas por secuencias no estructuradas o por motivos estructurales o funcionales específicos.