Withanolidos de Jaborosa reflexa

GARCÍA, M. E.; NICOTRA, V. E; BURTON, G.; OBERTI, J.C.

San Miguel de Tucumán, Argentina,

Congreso; XXVII Congreso Argentino de Química; 2008

Asociacion Quimica Argentina

                                     WITHANOLIDOS DE JABOROSA REFLEXA   Manuela E. García,a Viviana E. Nicotra,a Gerardo Burton,b Juan Carlos Oberti a   a Depto. de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Químicas (IMBIV-CONICET), Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba (CP5000), b Depto. de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad de Buenos Aires (CP1428). E-mail: jco@fcq.unc.edu.ar     INTRODUCCIÓN Los productos naturales constituyen una de las principales fuentes de agentes medicinales. La detección y caracterización de estas sustancias tienen aplicación en muy diversos campos, como en la medicina, farmacia, industria cosmética, alimentaria, entre otras. Este trabajo se refiere al estudio de metabolitos secundarios de naturaleza esteroidal, llamados withanólidos (w.), encontrados en 18 géneros de la familia Solanaceae. El estudio de dichos metabolitos ha merecido al momento varias revisiones.[1] Solanaceae es una de las familias de plantas más grandes, contiene 6 subfamilias, 96 géneros y 2.300 especies.[2] Esta familia es muy importante como fuente de fármacos. Figura 1. Esqueleto típico de un w. Los w. son compuestos esteroidales de 28 átomos de carbono, constituídos por un esqueleto tipo ergostano, polioxigenados, con una lactona-a,b insaturada en la cadena lateral, de 5 o 6 miembros. (Figura 1). De las 23 especies que conforman el género Jaborosa se estudiaron hasta el momento 16 especies y todas contienen withanólidos. El género Jaborosa tiene la particularidad de que sus metabolitos secundarios poseen arreglos estructurales exclusivos, lo cual los convierte en prometedores marcadores taxonómicos. Las principales propiedades biológicas de los w. dieron lugar a varias revisiones en los que se describen w. con actividad antibiótica, antitumoral, antiinflamatoria, inmunomoduladora, hepatoprotectora, antialimentaria contra insectos, quimiopreventiva,[3] fitotóxica, entre otras. Hasta el momento se han encontrado varios w. con actividad fitotóxica selectiva sobre especies Dicotiledóneas; de esta manera podrían ser empleados como selectivos controladores del fitocrecimiento de especies malezas Dicotiledóneas sin afectar a especies de cultivo Monocotiledóneas.[4] Este trabajo se refiere al estudio de withanólidos pertenecientes al género Jaborosa, puntualmente a la especie J. reflexa.   METODOLOGÍA El material vegetal seco y molido (85 gr.) se extrajo en frío con etanol. El extracto obtenido se procesó mediante distintas técnicas cromatográficas: C. Líquida al Vacío, C. en Columna, C. en Placa Delgada Preparativa, C. en Placa Delgada de Alta Resolución, entre otras. Se obtuvieron 3 compuestos de estructura novedosa: compuesto I (87,5 mg.); compuesto II (4,0 mg.) y compuesto III (8,4 mg.). La estructura química de los compuestos I-III fue determinada utilizando una combinación de experimentos de Resonancia Magnética Nuclear en 1 y 2 dimensiones: RMN-1H, RMN-13C, DEPT, COSY-60, HSQC y HMBC. Sobre el compuesto mayoritario (I) se realizó el ensayo de Fitotoxicidad utilizando semillas de Lactuca sativa (Dicotiledónea) y Avena sativa (Monocotiledónea). Las semillas de cada especie se incubaron in vitro, por triplicado, a distintas concentraciones (15 ppm; 150 ppm y 400 ppm). Se evaluó el crecimiento radicular y porcentaje de germinación  luego de 4 días del sembrado. Se calculó el porcentaje de inhibición de crecimiento en cada tratamiento respecto del tratamiento testigo, según la ecuación para el porcentaje de inhibición radicular (ec.1) y según la (ec.2) el desvío estándar del mismo.   %I = (1- (Lt / Lb)).100                                         (ec.1) SD%I = ((St/Lt)2 + (Sb/Lb)2)1/2 . %I                   (ec.2)   Donde %I es porcentaje de inhibición; SD %I, desvío estándar del porcentaje de inhibición; Lt es Longitud radicular promedio de las semillas tratadas y Lb es la longitud radicular del blanco o control. Los porcentajes de crecimiento radicular se compararon con sus respectivos controles usando el t-test de Student (p < 0,05).   RESULTADOS El estudio fitoquímico de la especie J. reflexa, dio lugar al aislamiento de tres  compuestos novedosos (Figura 2). El esqueleto del compuesto III es “normal”,[5] en cambio el de los compuestos I y II es de tipo sativólido,[6] posee un heterociclo adicional estable de seis miembros, formado a partir del ataque nucleofílico de un hidroxilo en posición C-21, sobre una cetona en C-12. Dicho esqueleto se hace evidente por la ausencia del metilo H3-21 y la aparición de señales en el espectro RMN-1H a d 3,956 dd y 3,634 t correspondientes a un metileno carbinólico sobre C-21. Además el espectro COSY muestra la correlación entre el H2-21 y H-20 con una constante de acoplamiento elevada (J = 11,3 y 5,3 Hz), lo cual sugiere que los C-20 y 21 forman parte de un anillo. La presencia de dicho heterociclo se confirma  mediante el pico de cruce en el espectro HMBC entre C-12 (d 100,7) y H2-21 (d 3,956 y 3,634 respectivamente). Figura 2: W. aislados de J.reflexa                                             EEEHHJKJJKNKJ                              Para evaluar la posible actividad fitotóxica del w. aislado de J. reflexa, se realizaron bioensayos sobre una especie Monocotiledónea (Avena sativa) y una Dicotiledónea (Lactuca sativa). Los resultados del procesamiento estadístico se muestran en la Figura 3. Figura 3: Efecto del w. I a diferentes concentraciones sobre el crecimiento radicular de la especie Monocotiledónea (Avena sativa) y Dicotiledónea (Lactuca sativa).         El compuesto I muestra efectos fitotóxicos  selectivos a 150 ppm, con un porcentaje de inhibición de 41,0% sobre la especie Dicotiledónea (lechuga) y un 6,6% sobre la Monocotiledónea (avena). No se observa dependencia de la actividad inhibitoria con la concentración.               CONCLUSION Se procedió a la purificación del material vegetal, se aislaron tres w. novedosos y se caracterizaron mediante una combinación de técnicas espectroscópicas en 1D y 2D. El estudio fitoquímico de la especie, evidenció la presencia de esqueletos de tipo normal y sativólido. El esqueleto sativólido es un arreglo exclusivo del género Jaborosa, lo que aporta mayor argumentación a la importancia de los w. como posibles marcadores taxonómicos, lo cual puede ser empleado por los botánicos como un elemento más de juicio para la ubicación de las especies vegetales, especialmente cuando se trata de géneros con valor taxonómico como lo es el género Jaborosa.[7] Según lo indicado anteriormente el compuesto III sería un precursor biogenético de I y II dada la funcionalidad en la posición C-12.[8] En cuanto al ensayo de fitotoxicidad realizado sobre el w. mayoritario aislado de J. reflexa (I), éste mostró un efecto inhibidor selectivo sobre la especie Dicotiledonea Lactuca sativa a 150 ppm. Es un resultado prometedor considerando que un número apreciable de w. ha mostrado comportamiento similar.[9]  Este resultado es de utilidad a la hora de realizar un estudio de relación estructura-actividad (REA) y a la posibilidad de encontrar un modelo de herbicida que permita controlar el crecimiento de especies Dicotiledóneas que sean malezas, sobre cultivos de especies Monocotiledóneas, que es además de bajo impacto ambiental.   [1] (a) Ray, A. B. & Gupta M. 1994. Prog. Chem. Org. J. Nat. Prod. (63) 1. (b) Veleiro A. S., Oberti J. C.; Burton G. Studies in Natural Products Chemistry (part L) Bioactive Natural Product; Elsevier Science Publishers. 2005, 32, 1019. [2] Hunziker, A., 2001. The Genera of Solanaceae. Ed. A. R. G. Gantner Verlag K. G. [3] Misico R, Kinghorn AD, Pezzuto J, Nicotra VE, Induction of Quinone Reductase by Withanolides, J. Nat. Prod., 2002, 65, 677-680. [4] Nicotra VE, Ramacciotti NS, Gil RR, Oberti JC, Feresin GE, Guerrero CA, Baggio RF, Garland MT, Burton G. Phytotoxic Withanolides from Jaborosa rotacea. J. of Nat. Prod. 2006, 69, 783-789. [5] Fajardo V, Podesta F, Shamma M, Freyer A. New withanólidos from Jaborosa magellanica . J.of Nat. Prod., 1991, 54 (2) ,554-563.  Ali M, Shuaib M,  Ansari S. Withanolides from  the stem bark of Withania somnifera. Phytochemistry, 1997, 44 (6) 1163-1168. [6] Bonetto GM, Gil RR, Oberti JC, Veleiro AS, Burton G. Novel Withanolides from Jaborosa sativa. J. of Nat. Prod. 1995, 58, 705-11.   Choudhary I, Shahwar D, et al. Antifungal steroidal lactones from Withania coagulance. Phytochemistry, 1995,40 (4), 1243-1246. [7] Barboza G, Hunzinker A. Estudios sobre Solanaceae XXV. Revisión de Jaborosa. Kurtziana 1987; 19, 77-153. [8] Ramacciotti NS, Nicotra VE. Withanolides from Jaborosa kurtzii. J. of Nat. Prod. 2007, 70, 1513-1515. [9] Nicotra VE, Gil RR, Oberti JC, Burton G. Withanolides with Phytotoxic Activity from Jaborosa caulescens var. caulescens and J. caulescens var. bipinnatifida. J. of Nat. Prod. 2007, 70, 808-812.