Hibridación in situ fluorescente en plantas: su aplicación en estudios de expresión génica, estructura y evolución cromosómica

MOSCONE, E. A.

Pergamino (Argentina)

Congreso; XXXVI Congreso Argentino de Genética; 2007

Sociedad Argentina de Genética

Desde su creación el método de hibridación in situ fluorescente (FISH), con su variante el pintado genómico (GISH), se ha convertido en una herramienta de gran utilidad para los estudios citogenéticos, particularmente en conjunción con estudios moleculares, que ha permitido arrojar luz sobre la estructura y evolución cromosómica y la expresión génica. En esta presentación se muestran resultados de su aplicación en diversos grupos de plantas, referidos a la localización de distintos tipos de DNA: 1) secuencias repetidas funcionales: genes de RNA ribosómico 5S y 45S [Phaseolus (Leguminosae) y Capsicum (Solanaceae)] y secuencias teloméricas [Capsicum y Cephalanthera (Orchidaceae)], 2) secuencias repetidas no funcionales: DNA satélites [Capsicum y Ornithogalum (Hyacintaceae)], 3) secuencias de bajo número de copias: transgenes y 4) DNA genómico [Nicotiana tabacum (Solanaceae)]. Entre los logros alcanzados mediante FISH se destaca la identificación de los pequeños cromosomas de Phaseolus (2,40 µm en promedio) por el mapeo de los sitios de rDNA 5S y 45S, hallazgo que hizo posible la ulterior integración de los mapas físico (cromosomas citogenéticamente reconocidos) y genético (grupos de ligamiento) del poroto común (P. vulgaris). Por otro lado, la localización de secuencias teloméricas en Capsicum permitió reforzar el esquema propuesto sobre su posible evolución cromosómica, que indica el carácter derivado de x=13 y su aparición dos veces de manera independiente en la historia del género, mientras que en Cephalanthera, demostró la reducción en el número básico (de x=11 a x=7) durante la evolución del género por la ocurrencia de cambios robertsonianos, i.e., fusiones céntricas. Con respecto a la caracterización de la heterocromatina, en Ornithogalum se puso en evidencia una composición diferente de secuencias satélite para la heterocromatina centromérica en relación a la intercalar, mientras que en Capsicum, se aportaron datos sobre la posible participación de DNA satélite derivado del espaciador intergénico (IGS) del rDNA 45S y elementos transponibles en su estructura. En particular, la aplicación de GISH doble y tinción fluorescente con DAPI en N. tabacum posibilitó la identificación de sus cromosomas en base a su pertenencia genómica, tamaño, morfología, presencia de loci de rDNA, translocaciones intergenómicas y patrón de bandeo heterocromático. Además, la combinación de GISH/FISH en un solo experimento permitió mapear citogenéticamente transgenes. Se demostró la influencia de la posición cromosómica en los niveles de expresión transgénica, ya que insertos localizados en la vecindad de los telómeros manifiestan expresión estable, mientras que otros ubicados en regiones intercalares o paracentroméricas se expresan de manera inestable. Finalmente, GISH doble resultó valioso para caracterizar plantas haploides de tabaco utilizadas en transgénesis. Se discute la influencia de las variantes de los protocolos y el tamaño de la secuencia blanco a localizar en la obtención de resultados, donde la menor secuencia detectada mediante FISH en este laboratorio fue un transgén quimérico con unas 5 Kb de longitud.