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El propósito del presente estudio fue diseñar un método de infección in vitro para evaluar el desarrollo de Enterococcus faecalis en el conducto radicular. Métodos: se seleccionaron 48 premolares humanos recién extraídos distribuídos en los siguientes grupos: Grupo A : menores de 25 años y Grupo B : mayores de 50 años. A su vez cada grupo fue subdividido en 2 subgrupos de 12 premolares cada uno: Subgrupos A1 y B1 y Subgrupos A2 y B2. En los Subgrupos A1 y B1 los conductos se irrigaron con Na OCl 5%, EDTAy Tiosulfato de Sodio 10%. Los Subgrupos A2 y B2 se irrigó con Solución Salina. Posteriormente todos los dientes fueron esterilizados con óxido de etileno y luego mediante inyección fueron infectados con un inóculo de Enterococcus faecalis, ATCC 29212. La totalidad de la muestra incubada a 37 º durante 60 días. Concluído este período se tomaron muestras en los conductos para ser sembradas en placas agar. El recuento bacteriano fue correlacionado por lectura espectrofotométrica a 600 nm. Finalmente, se seleccionaron al azar 2 dientes de cada grupo (8 en total) para ser evaluados en MEB, para corroborar la efectividad del método de infección. Resultados: En todos los grupos se observó crecimiento bacteriano en el conducto radicular. Los valores de absorvancia fueron ligeramente mayor en el grupo A, pero al aplicar el test Test de Mann-Whitney el resultado no fue estadísticamente significativo (P = 0,182). En los grupos A1 y B1 se observó desarrollo bacteriano en los túbulos dentinarios mientras que en A2 y B2 no. Conclusión: El acondicionamiento previo de las paredes dentinarias del conducto con NaOCl, EDTA y Tiosulfato de sodio, facilita la infección dentinaria puesto que permite que la bacterias penetren en los túbulos dentinarios.