Informe Científico Técnico de Avance 2

VIVIANA, PARREÑO; PUNTEL, MARIANA; SOSA HOLT, CARLA

2018-11-13/2019-01-11

1-19

Biológica

Enf.Endemicas-Enf.infecciosas respirat.

Nanoanticuerpos VHH mono y multivalentes contra el virus de Influenza A de aplicación profiláctica y terapéutica.OBJETIVOS ESPECÍFICOS1- Expresión de monómeros VHHs específicos para HA de virus de Influenza tipo A.2- Caracterización bioquímica de VHHs monoméricos por ELISA contra el virus completo, ELISA contra HA0 recombinante, Western blot contra el virus completo, HA0, y análisis de resonancia del plasmón (técnica de Biacore).3- Caracterización funcional in vitro: inhibición de la hemoaglutinación y neutralización de la infección viral en células con diferentes cepas de influenza A.4- Desarrollo y expresión de multímeros (homo y hetero) de aquellos clones con actividad neutralizante.5- Estudios de eficacia de la inmunización pasiva con VHH monoméricos y multiméricos con actividad neutralizante, frente al desafío con virus infeccioso en el modelo ratón (sin transmisión por aerosol), utilizando la cepa pandémica H1N1.6- Estudios de eficacia de la inmunización pasiva con VHH monoméricos y/o multiméricos, con superior capacidad protectora en el modelo ratón, frente al desafío con virus infeccioso en el modelo hurón (con transmisión por aerosol), utilizando la cepa pandémica H1N1.HIPÓTESIS DE TRABAJO Los nanoanticuerpos VHH monovalentes contra la proteína HA del virus Influenza resultan herramientas eficaces en tratamientos terapéuticos y preventivos de la infección por la cepa H1N1, en ensayos pre-clínicos. Los nanoanticuerpos VHH multivalentes contra la proteína HA del virus Influenza resultan herramientas de superior eficacia que sus contrapartes monoméricas, en tratamientos terapéuticos y preventivos de la infección por la cepa H1N1 y otras cepas endémicas, en ensayos pre-clínicos.RELEVANCIA DEL PROBLEMAGripe causada por Influenza tipo AEn el año 2009 el Influenzavirus A H1N1 originó una pandemia causada por una variante que surgió en América del Norte. El origen de la infección fue una variante de la cepa H1N1 con material genético proveniente de una cepa aviar, dos cepas porcinas y una humana que sufrió una mutación y dio un salto entre especies de los cerdos a los humanos, para después permitir el contagio de persona a persona. La pandemia se extendió globalmente y duro 14 meses ocasionando 19.000 víctimas mortales. En la Argentina la pandemia H1N1 que se produjo en el año 2009 generó 1.390.566 personas infectadas y 617 muertes reportadas(10). La circulación viral de Influenza quedo restringida a la cepa H1N1 en forma predominante comparada con otras infecciones virales respiratorias estacionales.Actualmente, la estrategia de prevención recomendada es la vacunación de la población con vacunas inactivadas monovalentes y trivalentes. Además de vacunas, han sido aprobadas para su uso en pacientes drogas como los inhibidores de la NA, y de la proteína de matriz (M). De manera alarmante, el uso de estas drogas ha generado una presión de selección que fomentó la emergencia de cepas resistentes de modo que más de un 90% de las cepas que infectan humanos, aves y cerdos son resistentes a estos antivirales (4,11).Los virus de influenza A tienen la capacidad de escapar a la respuesta inmune del huésped, generar resistencia a fármacos antivirales e infectar a distintas especies además de aquella en la que establecen normalmente la infección (Manjarrez Zavala, 1999; Beigel and Bray, 2008). Estas capacidades específicas se deben principalmente a dos mecanismos: 1) su alta tasa de mutación y 2) la generación de virus reasortantes -2 virus distintos infectan una misma célula y la progenie viral hereda una combinación del material genético de los virus.CONSTRUCCION DE LA HIPOTESIS y JUSTIFICACION GENERAL DE LAMETODOLOGIA DE TRABAJOLos anticuerpos neutralizantes resultan una estrategia de opción tanto para su aplicación en la prevención como en el tratamiento de la enfermedad. Este tipo de anticuerpos producidos luego de la infección mayoritariamente tienen como blanco la hemoaglutinina viral (HA). La subunidad HA1 constituye el sitio blanco para terapias que involucran la neutralización con anticuerpos serotipos específicos, mientras que el domino HA2 correspondiente al tallo de la HA, que se encuentra ampliamente conservado entre cepas, constituye el un blanco ideal para la nuetralización de multiples cepas (5).Los fragmentos de anticuerpos VHHs son rápidamente eliminados de circulación dado su bajo peso molecular, por lo que resulta fundamental la aplicación de estrategias que generen en el aumento de la vida media de las moléculas. La conjugación de VHHs monoméricos y multiméricos con PEG, o la fusión con un dominio de pegado a seroalbúmina, son procedimientos de demostrada eficacia para aumentar la vida media, farmacocinética y farmacodinamia de pequeñas moléculas en sangre (18).La diferencia más llamativa entre VHHs y anticuerpos humanos son unos 10 aminoácidos a lo largo de la estructura de la molécula. Se trata de sustituciones de aminoácidos frecuentemente encontradas en los anticuerpos provenientes de camélidos, con referencia al anticuerpo homologo encontrado en humanos. Estas sustituciones se hallan acotadas a una región altamente conservada del dominio VH (9). La mayoría de los cambios son sustituciones de aminoácidos hidrofóbicos por hidrofilicos que son fundamentales en cuanto a que aumentan la solubilidad de la molécula. Previamente al uso terapeutico y dadas las diferencias expuestas entre moleculas de origen humano y de camelidos, es ampliamente recomendada la humanizacion de los VHHs.En el presente proyecto se propone el diseño, caracterización bioquímica y funcional de nano-anticuerpos VHH monovalentes y multivalentes dirigidos contra las proteínas estructurales HA0, HA1 y HA2 del virus de influenza A, H1N1 pandémica; con potencial aplicación en profilaxis y tratamiento de la infección.Primeramente, se propone el analisis bioquimico y funcional in vitro de los VHH monovalentes. Luego la evaluación funcional in vivo en el modelo ratón (modelo de infección sin transmisión por aerosoles). Sólo los clones que presenten capacidad protectiva frente a la infección letal por influenza, serian modificados para el consiguientre diseño de un antiviral. Se procederá a la humanización de los clones más eficaces. Se generarán multímeros de los VHHs que serán analizados en su capacidad neutralizante in vitro -frente a la cepa homologa y cepas heterologas de influenza. La eficacia in vivo se evaluará en el modelo ratón en comparación con sus contrapartes monoméricas. Las moléculas que presenten los mejores resultados serán evaluadas en un modelo huron, que sí presenta transmisión por aerosoles. De esta manera planteamos el desarrollo de nanomoleculas de potencial uso en la terapia y prevención de la infección por Influenzavirus, en modelos preclinicos.