Evaluación funcional de la sobrexpresión del gen MSN2 en Saccharomyces cerevisiae

VIÑARTA, SILVANA C.; PERDIGÓN, MARIANA DV; AYBAR, MANUEL J.; MAZA, DÉBORA D.

San Miguel de Tucumán

Simposio; V Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2018

Evaluación funcional de la sobrexpresión del gen MSN2 en SaccharomycescerevisiaePerdigón1, M.dV; Maza1, D.D; Viñarta2, S.C; Aybar1, M.J1) Instituto Superior de Investigaciones Biológicas (INSIBIO), CONICET-UNT, e Institutode Biología, FBQF, UNT. Chacabuco 461, S. M. de Tucumán, Argentina.2) Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos (PROIMI)-CONICET. Av. M.Belgrano 2960, S. M. de Tucumán, Argentina.marper1046@gmail.com; m.aybar00@gmail.comResumenLos factores de transcripción MSN2 y MSN4 en condiciones de estrés forman dímeros e ingresanal núcleo donde se unen al elemento STRE de la región promotora de numerosos genes y activala transcripción de estos en respuesta a diferentes tipos de estrés (oxidativo, osmótico, térmico,falta de nutrientes, etc.). En condiciones normales MSN2/4 no participan en la viabilidad celular.En el presente trabajo se analizó el efecto del estrés generado por diferentes concentraciones devinaza y etanol sobre el crecimiento y viabilidad de Saccharomyces cerevisiae 3346 (Wt) ySaccharomyces cerevisiae 3347 (MSN2-OE). En ambas condiciones se observó una marcadadisminución del crecimiento y viabilidad de S. cerevisiae a medida que se aumentó laconcentración de vinaza o etanol comparada con los controles. También se evaluó el número decélulas vivas a 12 y 24 h de incubación por tinción y conteo directo de las levaduras bajocondiciones de estrés. La cepa que sobreexpresa MSN2 bajo un promotor constitutivo TDH3(MSN2-OE) presentó un mayor un números de células vivas en 18% de etanol comparada con laWt. El gen MSN2 es clave para la respuesta al estrés oxidativo y su expresión es necesaria paramantener las células vivas bajo condiciones de cultivo adversas.Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae, gen MSN2, estrés, vinaza, etanol.1-IntroducciónSaccharomyces cerevisiae participa en la producción de una gran variedad de productosbiotecnológicos. Dentro de los más relevantes se puede mencionar el bioetanol, vino, cervezaentre otros. S. cerevisiae fue elegida como organismo modelo para éste estudio debido a lasgrandes ventajas que presenta. Msn2p y Msn4p son proteínas que pertenecen a la familia de?dedos? de zinc C2H2 y se unen a la secuencia STRE (del inglés STress Responsive Element).Cuando la levadura se encuentra en condiciones normales de crecimiento, los factores detranscripción Msn2p y Msn4p se encuentran en el citoplasma, lo cual impide que estos factoresactiven sus genes blancos. En condiciones de estrés Msn2/4 forman dímeros e ingresar al núcleo,se unen al elemento STRE que se encuentra en la región promotora y activan la transcripción degran variedad de genes en respuesta a diversos estrés (Martinez‐Pastor et al., 1996). En el genomade S. cerevisiae se predicen 186 genes con el elemento STRE en su región promotora. El objetivode éste trabajo fue evaluar funcionalmente la sobrexpresión del gen MSN2 en S. cerevisiae bajodiversas condiciones de cultivo con el objeto de determinar el rol de este factor de transcripciónen respuesta al estrés.2-MetodologíaSe utilizó una cepa de S. cerevisiae 3346 (Wt) y S. cerevisiae 3347 (MSN2-OE que sobreexpresaMSN2 bajo un promotor constitutivo fuerte TDH3). Se realizaron curvas de crecimiento,viabilidad y se determinó el número de células vivas a diferentes tiempos. Para lo cual se empleóErlenmeyers con medio YPD y concentraciones variables de vinaza (10-25 % p/v) o diferentesconcentraciones de etanol (5, 10 y 18%). Estos medios se inocularon al 10% (p/v) y se incubarona 220 r.p.m, 28°C durante 30 h. Se analizó la evolución del crecimiento tomando muestras adistintos intervalos de tiempo. Se midió la densidad óptica a λ = 630 nm. El efecto de la vinaza oel etanol sobre la viabilidad de S. cerevisiae se evaluó por medio de la técnica de la microgota.Para realizar el conteo en placa, las muestras se diluyeron varias veces, se tomaron 10 µl de cadadilución y se sembró sobre placas de Petri con medio YPD agar. Se incubaron a 28 °C en formainvertida por 24 h. Se consideraron aquéllas placas que poseían entre 5 a 100 colonias, pararealizar un adecuado análisis estadístico. El número de células vivas y muertas se determinó pormedio recuento directo en cámara de Neubauer, utilizando como colorante vital eritrosina 0,02%.Se tomaron muestras de cada cultivo a 12 y 24 h de incubación y a cada muestra se le agregó100µl de colorante, se colocó una alícuota de ésta mezcla en la cámara y se realizó el recuento almicroscopio con aumento de 40x.3-Resultados y DiscusiónSé observó que la vinaza y el etanol tuvieron un efecto negativo sobre el crecimiento de ambascepas de S. cerevisiae a medida que se aumentó la concentración, observándose un periodo deadaptación de aproximadamente de 3 h a diferencia de la cepa control. Un efecto similar fuereportado por Selim y cols, los cuales observaron que la vinaza concentrada egipcia (80% v/v)obtenida como residuo de la producción de etanol tuvo un efecto adverso sobre el crecimiento deD. hansenii, K. fragilis y S. cerevisiae (Selim, Elshafei, & El-Diwany, 1991). Otro grupocorroboró que una concentración del 15% de vinaza de caña de azúcar ejerció un efecto inhibitoriosobre el crecimiento de diferentes especies fúngicas fitopatógenas del suelo, como ser P.parasitica, F. oxysporum f.sp. melonis, P. aphanidermatum y S. sclerotiorum (Santos, Diánez, DeCara, & Tello, 2008). Según Ding y cols, el aumento de la concentración de etanol como productoprimario de fermentación, influye en la fluidez de la membrana y es tóxico para las proteínas, loque provoca la inhibición del crecimiento celular e incluso la muerte (Ding et al., 2009). Estoexplicaría la ausencia de crecimiento en medio con 18% etanol. S. cerevisiae Wt incubada en 5%de etanol alcanzó su máximo crecimiento a las 12 h mientras que S. cerevisiae MSN2-OE loalcanzó a las 24 horas, esto se debe a la sobreexpresión de MSN2, ya que su metabolismo no estácentrado solo en el crecimiento sino que también sintetiza otras moléculas asociadas a MSN2. Laviabilidad celular disminuyó a medida que se aumentó la concentración de etanol. El número decélulas vivas de la cepa MSN2-OE en los medios con etanol fue del 94% comparada con la Wt,en la cual sólo el 70% estaban vivas. En los medios con 10% de vinaza, la viabilidad de ambascepas fue mayor con respecto al control, mientras que a una concentración del 25% disminuyóconsiderablemente. Esta mayor viabilidad podría deberse a qué la vinaza le proporciona algúncomponente esencial que le permite aumentar la viabilidad, superando incluso a las cepascultivadas en medio YPD. Blomberg demostró que la proliferación celular se reanuda después deun período de adaptación, el cual varía dependiendo de un número de factores, como el tipo, laseveridad del estrés, el fondo genético de la cepa y el estado de celular (Blomberg, 2000). Elnúmero de células vivas fue del 99% de ambas cepas cultivadas en vinaza. No se observó unadiferencia significativa con respecto a las cepas control. Éstos resultados indican que lasobreexpresión del gen MSN2 le estaría otorgando a S. cerevisiae una mayor capacidad detolerancia a altas concentraciones de etanol.4-ConclusionesUna concentración de etanol del 18% produjo perdida de viabilidad en ambas cepas, pero lasobreexpresión del gen MSN2 le otorgó a la cepa MSN2-OE una mayor tolerancia al etanolobservándose un mayor de número de células vivas. Ambas cepas de S. cerevisiae mostraronmayor viabilidad en un 10% de vinaza. En base a esto se podría usar la vinaza como un medioalternativo para la producción de biomasa celular en muchos procesos industriales, lo cual encierta medida sería una solución a los problemas de contaminación generados por la vinaza. Eluso de cepas tolerantes al etanol tiene gran interés desde el punto de vista económico y productivo,ya que pueden aplicarse a diversos procesos en los que están involucrados la fermentación ylevaduras que deben tolerar altas concentraciones de etanol, de ésta manera pueden obtenersemuy buenos rendimientos.5-BibliografíaBlomberg, A. (2000). FEMS microbiology letters, 182(1), 1-8.Ding, J., Huang, X., Zhang, L., Zhao, N., Yang, D., & Zhang, K. (2009). Applied microbiology andbiotechnology, 85(2), 253.Martinez‐Pastor, M., Marchler, G., Schüller, C., Marchler‐Bauer, A., Ruis, H., & Estruch, F. (1996).The EMBO journal, 15(9), 2227-2235.Santos, M., Diánez, F., De Cara, M., & Tello, J. (2008). Bioresource technology, 99(18), 9040-9043.Selim, M. H., Elshafei, A. M., & El-Diwany, A. I. (1991). Bioresource technology, 36(2), 157-160.EJE TEMATICO: Tecnología de cultivo celular.